工业微生物 chap5 微生物的代谢调节与控制.doc

第五章 微生物的代谢调节与控制 微生物代谢 (microbial metabolism) 是微生物最基本的特征之一，包括在微生物细胞中进行的所有生物化学反应。微生物的代谢作用包括合成代谢 (anabolism) 和分解代谢 (catabolism)，合成代谢又称同化作用，是指生物体从体内或体外环境中取得原料，合成生物体细胞的结构成分的过程，此过程需要提供能量；分解代谢又称异化作用，它与合成代谢正好相反，是指生物体内所有的分解作用，包括各种营养物质或细胞结构物质降解成简单分子，此过程往往伴随能量的释放。无论是合成代谢还是分解代谢，代谢途径都是由一系列连续的酶促反应构成的，前一步反应的产物是后续反应的底物。而且，合成代谢与分解代谢在生物体中偶联进行，分解代谢为合成代谢提供所需要的能量、中间产物和还原力，而合成代谢则是分解代谢的基础，提供酶、细胞结构、生长繁殖。微生物可通过氧化还原反应或光合作用产生能量，同时又通过生物合成作用利用这些能量来制造生物体的必需物质，在代谢活动中存在着明显的多样性。微生物细胞通过各种方式有效地调节相关的酶促反应，来保证整个代谢途经的协调性与完整性，从而使微生物细胞的生命活动得以正常进行。 第一节 微生物代谢的多样性一、微生物生物氧化的类型和产能生物氧化 (biological oxidation) 就是发生在活细胞内的一系列产能性氧化反应的总和。生物氧化不同于普通的氧化反应。首先，它们是由一系列酶在温和的条件下按一定次序催化的多步式梯级反应；第二，生物氧化反应放能是分段逐级进行的；第三，生物氧化反应中释出的能量一部分以化学能的形式储藏在ATP分子等能量载体内。根据微生物进行生物氧化时有无外界的最终电子受体，可以把微生物生物氧化分为呼吸和发酵两大类。没有任何外源的最终电子受体的生物氧化类型称为发酵，有外源的最终电子受体的生物氧化类型称为呼吸。再根据外源最终电子受体是不是分子氧，又可以把呼吸分为有氧呼吸和无氧呼吸。1. 有氧呼吸又称好氧呼吸 (aerobic respiration)，是一种最普遍又最重要的生物氧化或产能方式，其特点是底物脱下的氢经完整的呼吸链（respiratory chain，RC）又称电子传递链（electron transport chain，ETC）传递，最终被外源分子氧接受，产生了水并释放出ATP形式的能量。这是一种递氢和受氢都必须在有氧条件下完成的生物氧化作用，是一种高效产能方式。有氧呼吸是好氧和兼性厌氧微生物在有氧条件下进行氧化的方式。这时，化能异氧微生物以有机物为呼吸底物（能源）；化能自养微生物以还原态的无机化合物（如H2，H2S，S，S2O3，NH3和NO2等）作为呼吸底物（能源）。有氧呼吸中还存在两种形式：典型的一种是呼吸底物逐步被彻底氧化（如葡萄糖彻底氧化成CO2和水），释放的能量可与磷酸化过程相偶联，产生大量ATP；另一种是非典型的，呼吸底物脱下的氢和电子在氧化酶的作用下直接交给氧，产生脱了氢的底物和H2O2（如葡萄糖H2OO2葡萄糖酸H2O2能量），这个过程释放的能量不能与磷酸化过程偶联，即不产生ATP。参与这类反应的氧化酶都是以FAD或FMN为辅基的黄素蛋白，可称为黄素蛋白水平呼吸。2. 无氧呼吸又称厌氧呼吸 (anaerobic respiration)，指一类呼吸链末端的氢受体为O2以外的外源氧化物。这是一类在无氧条件下进行的、产能效率较低的特殊呼吸。其特点是底物脱氢后，经部分呼吸链递氢，最终由氧化态的无机物或有机物受氢，并完成氧化磷酸化产能反应。一些厌氧微生物和兼性厌氧微生物在无氧条件下营无氧呼吸。如：脱氮副球菌有：C6H12O64NO36 CO26 H2O2N2能量奥氏甲烷杆菌有：2C2H5OHCO22CH3COOHCH4能量值得注意的是在无氧呼吸过程中，电子供体和电子受体之间也需要细胞色素等起传递作用并伴随有磷酸化作用。由于有些能量随着电子转移至最终电子受体中，因此所生成的能量不如有氧呼吸多；此外，由于无机氧化物电子受体的氧化还原电位一般比较低（氧的氧化还原电位最高），因而还原酶系统产生的ATP通常比有氧呼吸时涉及的细胞色素氧化酶系统产生的ATP少。3. 发酵发酵（fermentation）是指在无氧等外源氢受体的条件下，底物脱氢后所产生的还原力H未经呼吸链传递而直接交某一内源中间代谢物接受，以实现底物水平磷酸化产能的一类生物氧化反应。其特点是以有机化合物作为电子供体（被氧化）和电子受体（被还原），电子的传递不经过细胞色素等中间电子递体，直接由电子供体交给电子受体，因此可以看作是分子内的转移。这种氧化作用不彻底，最终形成还原性产物，只放出一部分化学能，而大部分能量仍储存在还原性产物中。一个有机化合物完全氧化时产生的能量比其发酵作用大的多，例如，1mol葡萄糖完全氧化能释放出2.9106J的能量，而酵母菌利用葡萄糖进行酒精发酵时，糖的发酵作用只能释放大约十分之一的能量（2.3105J），其中9.6104J储存在ATP中，多余的能以热的形式散失，而大部分能量仍储存在酒精中。发酵作用是通过底物水平磷酸化合成ATP的；底物水平磷酸化也在呼吸作用中存在，但在呼吸作用中，更多的ATP是通过氧化磷酸化产生的。因而，每摩尔底物通过呼吸代谢产生的ATP比发酵代谢大的多。产能效率比：有氧呼吸无氧呼吸发酵。各种微生物都能进行发酵模式的生物氧化，除进行无氧呼吸的厌氧微生物外，发酵作用是许多厌氧微生物取得能量的唯一方式。好氧微生物在进行有氧呼吸的过程中也要经过发酵阶段，但在这种情况下，有机化合物的利用速度要比无氧时慢。无论是发酵作用还是呼吸作用，在氧化时都是先使辅酶NAD(P)还原成NAD(P)H（有少数是把脱氢酶的辅基，如FAD或FMN还原），但NADH上的电子和氢的去路不同，发酵时，电子转移给代谢中间物，形成发酵产物；呼吸时通过电子传递链将电子传递给外源最终电子受体。二、工业微生物重要的分解代谢途径及产物工业上使用的微生物绝大多数属化能异氧型，以糖类作为最重要和最普遍的碳源和能源。糖类作为氧化基质，通过各种降解方式形成构建菌体成分的中间代谢物，同时伴以能量的产生。微生物可利用的糖类包括多糖、双糖和单糖。淀粉、纤维素、半纤维素、果胶质和几丁质等多糖可被不同的微生物所利用，但必须被微生物分泌的相应的胞外酶水解成单糖或双糖后，才能被细胞所吸收。葡萄糖和果糖是化能异氧微生物的主要碳源和能源，戊糖是经转化后中途进入葡萄糖降解途径的。糖以外的其它有机化合物（包括醇、醛、有机酸、氨基酸、烃类、芳香族有机化合物）的代谢也都是经转化后进入葡萄糖降解途径的。因此，化能异氧型微生物进行分解代谢的最基本的途径就是葡萄糖降解的途径，或称单糖降解途径。微生物降解葡萄糖的方式很多，远比高等生物复杂，其降解途径及最终产物因微生物种类和发酵条件而异，主要有下列方式。（一）酵解途径糖的酵解是各种发酵的基础，发酵作用是酵解过程的发展。糖酵解（glycolysis）又称EMP途径（Embden-Meyerhof pathway），或双磷酸己糖降解途径。这是氧化葡萄糖产生丙酮酸的过程，它通常是碳水化合物分解过程的第一阶段。许多微生物能进行该途径的反应。事实上，它存在于大多数活细胞中。酵解途径包括10个独立的，但又是连续的反应，其顺序及所需的酶见图5-1。糖酵解中的酶催化六碳葡萄糖裂解生成两个三碳糖，这些糖然后进一步被氧化释放能量，同时进行原子的重排而形成了两分子丙酮酸。糖酵解期间NAD被还原成NADH，并且通过底物水平磷酸化作用净产生两分子的ATP。因此，葡萄糖经EMP途径降解成丙酮酸的总反应式为：C6H12O62NAD2Pi2ADP2CH3COCOOH2NADH22ATP2H2O反应中所生成NADH2必须重新氧化为NAD后才能继续不断地推动全部反应。糖酵解过程不需要氧的参与，它能够在无氧或有氧的条件下发生。在无氧的条件下，如以乙醛作为受氢体，即是酒精发酵；如以丙酮酸作为受氢体，即是乳酸发酵。在有氧情况下，NADH2经呼吸链氧化，同时丙酮酸进入三羧酸循环。EMP途径是多种微生物所具有的代谢途径，其产能效率虽低，但生理功能极其重要：供应ATP形式的能量和NADH2形式的还原力，厌氧微生物是以此途径作为获得能量的唯一方式；是连接其它几个重要代谢途径的桥梁，包括三羧酸循环（TCA）、HMP途径和ED途径等；为生物合成提供多种中间代谢物；通过逆向反应可进行多糖合成。若从EMP途径与人类生产实践的关系来看，则它与乙醇、乳酸、甘油、丙酮和丁醇等的发酵生产关系密切。图5-1 酵解途径简图（二）HMP途径除了通过糖酵解氧化葡萄糖外，大多数微生物还有一条彻底分解葡萄糖为CO2和水的途径，即是葡萄糖在转化成6-磷酸葡萄糖酸后就分解为CO2和5-磷酸核酮糖，也就是在单磷酸己糖的基础上开始降解，故称单磷酸己糖途径（hexose monophosphate pathway，简称HMP途径）。又因为所生成的磷酸戊糖可重新组成磷酸己糖，形成循环反应，所以又常称为磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway），见图5-2。图5-2 HMP途径简图HMP途径基本过程可分为3个阶段：葡萄糖分子通过几步氧化反应产生5-磷酸核酮糖和CO2；5-磷酸核酮糖发生结构变化形成5-磷酸核糖和5-磷酸木酮糖；几种磷酸戊糖在无氧参与的条件下发生碳架重排，产生了磷酸己糖和磷酸丙糖，后者既可以通过EMP途径转化成丙酮酸而进入TCA循环进行彻底氧化，也可通过醛缩酶的作用而转化为磷酸己糖。HMP途径的总反应式为：G-6-P12NADP6H2O6CO212（NADPHH）PiHMP途径比EMP途径复杂，可以获得很多产物，如C3、C5、C7等磷酸糖酯。该途径主要特点是葡萄糖直接脱氢和脱羧，不必先经三碳糖的阶段；另一特点是只有NADP参与反应。HMP途径在微生物生命活动中意义重大，主要有：供应5-磷酸核糖，以合成嘌呤和嘧啶核苷酸，最后合成核酸、辅酶等；提供大量的还原力NADPHH，除了部分被转氢酶催化变为NADHH，再进入呼吸链氧化，可生成大量的ATP外，主要还是作为细胞合成脂肪酸、胆固醇、谷氨酸等需氢的一种重要来源；途径中的4-磷酸赤藓糖是合成芳香族氨基酸的前体；磷酸戊糖循环的功能对于光能和化能自养菌具有重要作用，这两类微生物细胞中的含碳成分都是由CO2和1,5-二磷酸核酮糖缩合而成，而后者是由5-磷酸核糖转变而来；生成的6-磷酸果糖、3-磷酸甘油醛等可进入EMP途径，进而代谢为丙酮酸，这样HMP途径与EMP途径相联系。因此，HMP途径在物质代谢中很重要，在大多数好氧和兼性厌氧微生物中都有这条途径。HMP途径与EMP途径、TCA循环可以同时存在于一细胞内，只有少数细菌以HMP途径作为有氧分解的唯一途径，例如弱氧化醋杆菌（Acetobacter suboxydans）和氧化醋单胞菌（Acetomonas oxydans）。（三）ED途径N. Entner和M. Doudorff两人（1952年）在对Pseudomonas saccharophila（嗜糖假单胞菌）的研究时发现，该菌缺少6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，从葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖酸之后不氧化脱羧，而是在脱水酶作用下脱水，生成2酮3脱氧6磷酸葡萄糖酸（KDPG），后者由脱氧酮糖醛缩酶催化裂解成为3-磷酸甘油醛和丙酮酸（见图5-3），这就是ED途径（Entner-Doudorff pathway），又称2酮3脱氧6磷酸葡萄糖酸（KDPG）途径，其关键步骤是KDPG的3，3裂解，成为两个C3化合物。3-磷酸甘油醛转入EMP途径后半部分可转化为丙酮酸，因而ED途径的总反应式为：C6H12O6NADNADPPiADP2CH3COCOOHNADHNADPH2HATP图5-3 ED途径简图ED途径是少数EMP途径不完整的细菌所特有的利用葡萄糖的替代途径。由于它可与EMP途径、HMP途径和TCA循环等代谢途径相联，故可相互协调，满足微生物对能量、还原力和不同中间代谢产物的需要。所以ED途径也是微生物的一条重要代谢途径，广泛分布在细菌尤其是革兰氏阴性菌中。（四）PK途径和戊糖的利用除了常见的EMP途径、HMP途径和ED途径外，尚有两个磷酸酮缩酶途径（phosphoketolase pathway，简称PK途径）是少数细菌所有的，例如异型乳酸发酵的乳酸杆菌、双叉乳杆菌和双歧杆菌等，因为该途径的部分与HMP途径相同，所以可认为是HMP途径的分叉。1. 磷酸戊糖酮缩酶途径磷酸戊糖酮缩酶途径（phospho-pentose-ketolase pathway，简称PPK途径）是HMP途径的变异途径。葡萄糖或戊糖都可作为碳源，当以葡萄糖为碳源时，经HMP途径的前部分，分解为5-磷酸核酮糖和CO2，然后5-磷酸核酮糖异构化生成5-磷酸木酮糖；戊糖作碳源时，它们进入细胞并发生磷酸化，然后也转化成5-磷酸木酮糖。5-磷酸木酮糖是戊糖代谢的关键中间代谢物，在磷酸戊糖酮缩酶催化下进行2，3裂解，生成乙酰磷酸和3-磷酸甘油醛，该酶是PPK途径的关键酶，所催化的磷酸戊糖2，3裂解是关键步骤。生成的乙酰磷酸被还原为乙醇，3-磷酸甘油醛沿EMP途径后半部分转化为乳酸，同时产生2ATP，扣除发酵开始时用来激活葡萄糖所消耗的1个ATP，净得1ATP（见图5-4a），这就是肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、发酵乳杆菌（L. fermentum）等以及真菌中的根霉所进行的异型乳酸发酵路线，总的反应式为：葡萄糖ADPPi乳酸乙醇CO2ATP乳酸菌如戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）和肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）以及真菌中的镰刀菌（Fusarium）进行戊糖发酵时，通过磷酸戊糖2，3裂解的途径，但产物中有乙酸而没有乙醇，产生的能量也比以葡萄糖为碳源的异型乳酸发酵高，这是因为在生成乙酸的过程中有ATP的产生（见图5-4b），其总反应式为：戊糖2ADP2Pi乳酸乙酸2ATP图5-4 PPK途径a为利用葡萄糖，b为利用核糖。图中由3-磷酸甘油醛至丙酮酸的5步反应仍沿EMP途径。己糖激酶，6-磷酸葡萄糖脱氢酶，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，5-磷酸核酮糖异构酶，磷酸戊糖酮缩酶，磷酸转乙酰酶，乙醛脱氢酶，醇脱氢酶，同EMP途径相应酶，乳酸脱氢酶2. 磷酸己糖酮缩酶途径少数细菌，如两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）等缺少6-磷酸葡萄糖脱氢酶（则不可能有HMP途径），又缺少果糖二磷酸醛缩酶（则不可能有EMP途径），在利用葡萄糖的途径也不同于ED途径或PPK途径，而是走一条特殊的磷酸己糖酮缩酶途径（phospho-hexose-ketolase pathway，简称PHK途径）。其特点是该途径有两步反应是由磷酸酮缩酶所催化的，第一步是由6-磷酸果糖酮缩酶将6-磷酸果糖分解为乙酰磷酸和4-磷酸赤藓糖，另一步是5-磷酸木酮糖酮缩酶将5-磷酸木酮糖分解为3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸，在没有氧化作用和脱氢作用的反应参与下，2分子葡萄糖分解为3分子乙酰磷酸和2分子3-磷酸甘油醛，后者在3-磷酸甘油醛脱氢酶和乳酸脱氢酶参与下转变为乳酸，乙酰磷酸则与ATP的生成反应相偶联成为乙酸（见图5-5）。从葡萄糖开始，总反应式为：2葡萄糖5ADP5Pi2乳酸3乙酸5ATP图5-5 PHK途径己糖激酶和6-磷酸葡萄糖异构酶，6-磷酸果糖酮缩酶，转醛醇酶，转酮醇酶，5-磷酸核糖异构酶，5-磷酸核酮糖异构酶，5-磷酸木酮糖酮缩酶，乙酸激酶，同EMP途径相应酶（五）葡萄糖直接氧化途径上述四条途径都是葡萄糖先磷酸化后才逐步被降解的。有些微生物如酵母属（Saccharomyces）、假单孢菌属（Pseudomonas）、气杆菌属（Aerobacter）和醋杆菌属（Acetobacter）的某些菌，它们没有己糖激酶，但有葡萄糖氧化酶，便直接将葡萄糖先氧化成葡萄糖酸，再磷酸化生成6-磷酸葡萄糖酸，假单孢菌中的6-磷酸葡萄糖酸经6-PG脱水酶转化为KDPG，按ED途径进一步降解；气杆菌属和醋杆菌属以及另一些假单孢菌中的6-磷酸葡萄糖酸经6-PG脱氢酶转化为5-磷酸核酮糖，进入HMP途径。（六）三羧酸循环葡萄糖除了上面几种途径降解，得到各种中间体的代谢产物外，好氧微生物在有氧情况下，通过三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，简称TCA循环）完全氧化，生成各种生物合成的中间体、CO2和水，同时产生大量的还原力（NADPH2、NADH2和FADH2），这些还原力通过电子传递链生成ATP。这是一个广泛存在于各种生物体中的重要生物化学反应，在各种好氧微生物中普遍存在。葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸后，丙酮酸不能直接进入三羧酸循环。在有氧情况下，丙酮酸需要失去1分子的CO2，降解成乙酰CoA，此反应分五步由丙酮酸脱氢酶复合物催化完成。这一反应本身并非是三羧酸循环的一部分，但它是所有糖类经丙酮酸进入三羧酸循环所必须经过的。三羧酸循环也叫柠檬酸循环（citric acid cycle）或Krebs循环（the Krebs cycle）。在三羧酸循环中，通过一系列的生化反应途径，储存在乙酰CoA中大量潜在的化学能被逐步释放出来。在这个循环中，通过一系列氧化和还原反应把化学潜能以电子的形式转移到电子载体（主要是NAD）上。丙酮酸的衍生物被氧化，辅酶被还原。三羧酸循环的主要化学反应见图5-6，3C化合物丙酮酸脱羧后，形成NADHH，并产生2C化合物乙酰CoA，由它与4C化合物草酰乙酸缩合形成6C化合物柠檬酸。通过一系列氧化和转化反应，6C化合物经过5C化合物又重新回到4C化合物草酰乙酸，再由它接受来自下一个循环的乙酰CoA分子。整个三羧酸循环的总反应式为：丙酮酸4NADFADGDPPi3H2O3CO24（NADHH）FADH2GTP图5-6 三羧酸循环简图三羧酸循环不仅为机体提供大量的能量，而且三羧酸循环的中间产物是细胞进行生物合成的原料，它们是合成反应的起点成分。例如-酮戊二酸和草酰乙酸分别可合成谷氨酸族和天冬氨酸族氨基酸；琥珀酰CoA可作为卟啉环的前体；柠檬酸作为脂肪酸生物合成中线粒体内乙酰CoA的前体等。因此，三羧酸循环位于一切分解代谢和合成代谢中的枢纽地位。（七）乙醛酸循环乙醛酸循环（dicarboxylic acid cycle，DCA循环）又称二羧酸循环或TCA循环支路。DCA循环两个关键酶是异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶。某些二碳化合物难通过上述途径转化生成乙酰CoA，因此，它们不能从乙酰CoA进入TCA循环，如乙酸、乙醇酸、草酸等。乙酸通过乙酰CoA合成酶催化生成乙酰CoA；乙醇酸和草酸先转化成乙醛酸，然后借助于乙醛酸循环彻底氧化成CO2和H20，并生成2分子NADH2。DCA循环中，先在异柠檬酸裂解酶催化下异柠檬酸裂解为乙醛酸和琥珀酸，再在苹果酸合成酶作用下将乙醛酸和乙酰CoA合成苹果酸。DCA循环的生理功能是使微生物可在乙酸为唯一的碳源基质上生长；又可弥补TCA环中四碳化合物之不足；同时，在脂肪酸转化为糖的过程中起齿轮作用。DCA循环的总反应式为：2乙酸2NAD苹果酸2NADH2乙酰CoA乙醛酸2NAD苹果酸2NADH2（八）工业微生物重要的发酵类型及其产物微生物的发酵类型极其多样，不同的微生物对葡萄糖的发酵，其产物就很不一样，微生物所进行的各种发酵，常以其终产物命名。在糖酵解过程中生成的丙酮酸可被进一步代谢。在无氧条件下，不同的微生物分解丙酮酸后会积累不同的代谢产物。目前发现多种微生物可以发酵葡萄糖产生乙醇，能进行乙醇发酵的微生物包括酵母菌、根霉、曲霉和某些细菌。根据在不同条件下代谢产物的不同，可将酵母菌利用葡萄糖进行的发酵分为三种类型：如果以乙醛（丙酮酸脱羧）为受体生成乙醇，这种发酵称为酵母的一型发酵；当环境中存在亚硫酸氢钠时，不能以乙醛作为受体，而以磷酸二羟丙酮作为受体时，产物为甘油，称为酵母的二型发酵；在弱碱性条件下（PH7.6），乙醛因得不到足够的氢而积累，两个乙醛分子间会发生歧化反应，一个作为还原剂形成乙酸，一个作为氧化剂形成乙醇，受体为磷酸二羟丙酮，发酵产物为甘油、乙醇和乙酸，称为酵母的三型发酵。这种发酵方式不产生能量，只能在非生长的情况下进行。不同的细菌进行乙醇发酵时，其发酵途径也各不相同。如厌氧发酵单胞菌是利用ED途径分解葡萄糖为丙酮酸，最后得到乙醇。肠杆菌则是利用EMP途径来进行乙醇发酵。许多细菌能利用葡萄糖产生乳酸，这类细菌称为乳酸细菌。根据产物的不同，乳酸发酵有三种类型：同型乳酸发酵（利用EMP途径产物只有乳酸）、异型乳酸发酵（利用PK乳酸及部分乙醇或乙酸）和双歧发酵（利用双歧双歧杆菌发酵葡萄糖产生乳酸的一条途径）。许多厌氧菌可进行丙酸发酵、丙酮-丁醇发酵；某些肠杆菌可进行混合酸发酵，产物为乳酸、乙酸、甲酸、乙醇、CO2和氢气等。第二节 微生物初级代谢产物的代谢调节当一个微生物细胞被置于含有糖、氨和无机盐等培养基中，在适宜条件下培养时，它就将糖降解为三碳和二碳化合物，并将这些小分子物质送入三羧酸循环，提供合成细胞成分的中间产物和能量，再由这些中间产物转化成20种氨基酸、4种核糖核苷酸、4种脱氧核糖核苷酸，还有十多种维生素、几十种脂肪酸类和糖类，然后，这些小分子物质又合成为约两千多种蛋白质、DNA、RNA（mRNA、tRNA、rRNA）、多糖和脂类等生物大分子物质，它们被用来构成细胞结构，如细胞核、核糖体、细胞壁、细胞膜及线粒体等多种细胞器。所有这些分解和合成代谢都是由酶催化反应的。一个细胞可以有三千种酶，而每个蛋白质（多肽链）的合成需要一套基因，如一个大肠杆菌染色体DNA约含400万个碱基对，用于编码一个含500个氨基酸多肽的基因约有3000个。 一个细菌在正常条件下，每2060min繁殖一代，同时它只在一定的环境条件下，才生成某些分解代谢的酶和回补途径的酶。在一个细胞中存在着如此复杂的反应，繁殖速度又如此之快，但所有反应都是有条不紊、协调有效地进行，使得在能量或中间产物的供应上，既无不足又无过剩，保持各种代谢物的浓度相对稳定和动态平衡，结果使细胞得以生长。这样的能量利用之经济，对原料利用之合理，对细胞成分合成之迅速，以及对外界条件适应之灵敏，都说明了微生物细胞内具有高度严密的自我调节能力。 微生物具有比任何其它生物更为明显的自我代谢调节机能，这对于微生物本身非常重要，可使微生物有高度适应环境和自我繁殖能力。而对于微生物在工业上的应用，则有利也有弊：当以获得微生物细胞（如单细胞蛋白）为目的时，微生物的自我调节作用，避免了中间代谢产物的过量生成而造成能量和物料的浪费，这样使原料的利用更合理；对于以大量积累中间代谢产物或终产物的发酵（如有机酸、氨基酸、核苷酸、抗生素发酵），细胞的自我代谢调节，使中间产物或终产物不能过量生成，也不能排出体外。为了使微生物大量积累中间代谢产物或终产物，必须破坏或解除原有的调控关系并建立新的调节机制，使它按照人们的意愿，改变或控制代谢方向，从而使目的产物大量生成和积累。 微生物的自我调节作用都是通过协调控制酶来实现的，酶的生物合成受基因和代谢物的双重控制。一方面，从DNA分子水平上，酶的合成与普通蛋白质的合成一样，受基因的控制，基因决定了所形成的酶分子的化学结构；另一方面，是从酶学的角度考虑，酶的合成还受代谢物，如酶反应的底物、产物及其结构类似物的控制和调节，仅有某种基因，并不能保证大量产生某种酶。概括来说，微生物的代谢调节机制可分为以下3类：1. 通过控制基因的酶生物合成调控这类调控机制又可分为诱导与阻遏两种方式：(1)酶的诱导合成（enzyme induction）当有诱导物存在时，酶的生成量可以几倍乃至几百倍地增加。 (2)酶的阻遏生成（enzyme repression）这是停止或抑制酶合成的效应。根据阻遏物的不同而有三种类型： a.终产物反馈阻遏阻遏物为合成途径的终产物； b.分解代谢物阻遏阻遏物为另一个分解途径的产物； c.代谢互锁阻遏物与被阻遏物的酶是几乎不相关的合成途径的产物。2. 酶活性的控制这是通过改变已存在的酶的催化活性来控制的，包括以下三种类型：(1)终产物的抑制或激活；(2)酶原的活化；(3)通过辅酶水平的活性调节。3. 通过细胞膜通透性的调节在微生物中，细胞膜通透性的调节也是非常重要的。透性调节一方面有选择地将必需营养物输送到细胞内，另一方面使胞内必需的代谢物和大分子保留在一定的浓度，当终产物累积到引起反馈调节的浓度时，细胞立即停止该物质的合成，这样对微生物本身来说，不会造成浪费，保证微生物细胞能正常生长。但是，对于以大量积累某种代谢物为目的的发酵生产，必须通过改变细胞膜通透性，把属反馈控制因子的终产物迅速不断地排出于细胞外，从而打破这种反馈控制，大幅度地提高发酵产物的产量。一、 诱导酶的产生与反馈阻遏微生物细胞生长时，把碳、氮源和能源的高分子化合物分解为简单物质，再由此合成氨基酸、核苷酸、维生素和脂肪酸等中间产物，进一步再合成为蛋白质、核酸、脂类、多糖等高分子化合物，装配成具有特殊结构和功能的单元，完成细胞的生长、分化和繁殖。这种包括分解代谢和合成代谢的，产生对细胞生长、分化和繁殖必需的物质的代谢称为初级代谢（primary metabolism），例如，氨基酸、有机酸、核苷酸以及维生素等都属于初级代谢产物。从初级代谢产生的中间产物出发，合成一些生理功能不够明确、化学结构特殊，与维持生命活动无关，并不影响生命活动的代谢产物，这一过程称为次级代谢（secondary metabolism），例如，抗生素、色素、毒素等均属于次级代谢产物。由于初级代谢产物都是微生物营养性生长所必需的，因此，除了遗传上有缺陷的菌株外，活细胞中初级代谢途径是普遍存在的，各种微生物的初级代谢途径基本相同（只有几种初级代谢产物的合成途径在细菌和霉菌中略有差异，在同一类微生物，如细菌中不同的初级代谢产物合成途径是十分罕见的），但在调节机制上有较大的差异。而且初级代谢途径上的酶的特异性比次级代谢的酶要高，因为初级代谢产物合成的差错会导致细胞死亡的严重后果。初级代谢产物的生物合成途径是稳定的，不同微生物种的调节机制现在已基本弄清楚了。其调节机制模型参见图5-7，当底物葡萄糖进入微生物细胞之后，经过辅酶补充能量，细胞内所产生的各种诱导酶和合成酶1、2、3分别通过A、B、C、DX、Y各个阶段形成了最终代谢产物Z，而Z又反馈抑制诱导酶、合成酶的活性，同时也反馈阻遏诱导酶、合成酶的产生。图5-7 微生物代谢调节机制模型(一)酶的诱导合成 微生物体内参与代谢活动的酶，有些是细胞所固有的，经常存在于细胞内，以恒定速度和恒定数量生成，不随微生物的代谢状态而变化，这一类酶称为组成酶（constitutive enzymes）；而另一些酶，在一般情况下细胞内不生成或数量很少，这些酶只有在底物或其结构类似物存在时才生成，这一类酶被称为诱导酶（induced enzymes），引起酶生成的化合物叫诱导物。例如：有些细菌只生长在含有淀粉的培养基中才能产生淀粉酶；曲霉只有生长在含有蔗糖的培养基中才产生蔗糖酶，以大肠杆菌的-半乳糖苷酶的合成为例，更清楚地看到这种诱导效应。图5-8表示-半乳糖苷酶的合成与乳糖利用的关系，向大肠杆菌的细胞悬液中添加乳糖，很快就会发现细胞中-半乳糖苷酶的水平上升。在没有添加乳糖时，大肠杆菌细胞的这个酶的水平极低（只有用专门技术才能测出来），加入乳糖，使该酶水平上升约1000倍。图5-8 大肠杆菌细胞中-半乳糖苷酶的诱导组成酶和诱导酶是相对的概念，同一种酶，在这种微生物中是诱导酶，而在另一微生物中可能是组成酶。例如-半乳糖苷酶在大肠杆菌K12野生株中是诱导酶，而在该菌的一个突变株中则是组成酶。 酶的诱导合成现象是微生物普遍存在的，许多分解代谢的酶属于诱导酶类，如对糖、蛋白质、氨基酸以及芳香族化合物的降解利用。但有些合成酶类也是诱导酶类，如细胞色素、细菌叶绿素等的合成也是适应性的。例如，当酵母菌在有氧条件下，可以生成细胞色素，无氧时就消失，有氧时又恢复。 酶合成的诱导对于微生物是十分有意义的。从营养的角度看，微生物可以根据环境所提供的生长底物，诱导合成相应的酶，以分解生长底物，吸收营养，进行代谢活动，从而加强微生物对环境的适应能力。从细胞经济的角度看，微生物仅在需要时（存在底物时）才合成某些酶，在不需要时便不合成，这就避免了生物合成的原料和能量的浪费。（二）酶合成的反馈阻遏 当代谢途径中某终产物过量时，或培养基中已提供了此产物时，就会阻遏自身合成途径中第一个酶或其它关键酶的进一步合成，从而控制代谢的进行，减少终产物的生成。这种效应称为终产物阻遏（end product repression），通常称为反馈阻遏（feedback repression）。例如，大肠杆菌色氨酸合成酶（tryptophane synthetase）的生成就受到这种效应的调控，当在培养基中加入色氨酸时，在23min内细胞中酶的生物合成就停止了。 酶的阻遏在微生物中是很普遍的现象，常出现在与氨基酸、嘌呤、嘧啶的生物合成有关的酶中。 微生物具有终产物阻遏的调节系统，使得微生物在已合成足够它需要的物质时，或由外源加入该物质时，就停止生成其有关合成的酶类；而当该物质缺乏时，又开始生成这些酶，这种调节对微生物的好处也是显而易见的，可以节约细胞内大量的能量和原料。（三）酶合成的诱导和阻遏的机制 酶的诱导和阻遏以相反方向影响酶的生物合成，它们的作用机制是相似的，可以用Jacob和Monod提出的操纵子模型（Operon Model）来解释，并已得到实验上的证明。1. 操纵子学说 Jacob和Monod等于1960年代提出了操纵子学说，其要点是：在染色体的DNA链上有调节基因和操纵子（operon），操纵子包括一串功能相关连的结构基因、操纵基因和启动子。结构基因（structural gene）携带遗传信息，酶的合成是以结构基因为模板，在RNA聚合酶作用下转录出mRNA ，mRNA在核糖体上通过tRNA转译出相应的蛋白质（酶）；操纵基因（operator gene）不编码蛋白质，是与调节蛋白结合的部位，控制结构基因的转录；启动子（promotor）不编码蛋白质，是与RNA聚合酶结合的部位，只有RNA聚合酶与启动子结合后，才能启动结构基因转录，启动子是比较短的DNA片段，约100个核苷酸对；调节基因（regulatory gene）编码一种称为调节蛋白的特殊蛋白质，这是一种变构蛋白，有两个位点，一个位点与操纵基因结合，另一位点与称为调节物的特殊小分子物质结合，这种结合是可逆的，当调节物与调节蛋白结合后，便引起调节蛋白变构，变构了的调节蛋白能增加（即使其具有活性）或降低（即使其失去活性）与操纵基因结合的能力。2. 乳糖操纵子 大肠杆菌乳糖操纵子（图5-9）包括三个结构基因z、y、a（相应编码-半乳糖苷酶、-半乳糖苷透性酶和-半乳糖苷转乙酰酶）和结构基因前面的操纵基因（O）和启动子（P），这三种酶都能被乳糖或-半乳糖苷系列化合物所诱导。其作用机制是：当不存在诱导物时，由调节基因所合成的阻遏物附着在操纵子“O”的部位，此时从启动子部位开始的由RNA聚合酶合成mRNA的活动受到了阻遏，酶就无法生成。如果有诱导物质存在，阻遏物与诱导物质相结合失去了阻遏活性，此时与操纵基因相结合的部位就被解除了，从而能进行mRNA的合成，此时酶即可产生。此外，cAMP以及CRP（cAMP receptor protein）都参与乳糖操纵子的调控，当cAMP和CRP相结合附着在启动子上游部位时，就能促进从启动子部位开始的RNA聚合酶的活动。 若操纵基因发生突变，就会降低它对阻遏蛋白的亲和力，而在没有诱导物的情况下也能提高这三个酶的合成速度，这称为操纵区组成突变体（Oc突变体）。另外还有阻遏物基因突变（Rc），不再产生调节蛋白，因而就解除了控制。图5-9 大肠杆菌乳糖操纵子的作用机制根据乳糖操纵子的作用机制可以画出诱导的模式图（图5-10）。图5-10 诱导的模式图从模式图可以看出诱导酶的合成机制，其本质就是解阻遏（诱导物解除了阻遏蛋白对操纵基因的阻塞）。值得注意的是，这种诱导物与阻遏蛋白的结合是可逆的，结合或解除结合取决于细胞内效应物的浓度。正因为结合是可逆的，所有调节可以双向进行。3. 色氨酸操纵子 大肠杆菌的色氨酸操纵子含有五个结构基因和一个操纵基因，见图5-11。图5-11 大肠杆菌生物合成色氨酸的代谢调节机制它参与从分支酸（chorismic acid）生物合成色氨酸的代谢调节机制。由于没有过量的色氨酸存在，阻遏物质没有活性，因此不能附在操纵子部位而合成mRNA。一旦加入色氨酸，无活性阻遏物则与色氨酸相结合形成活性型附在操纵子上，从而阻止mRNA的合成。所以，当培养基中有可以利用的色氨酸存在时，大肠杆菌就不会合成与色氨酸合成途径有关的酶。根据色氨酸操纵子的作用机制可以画出反馈阻遏模式图（图5-12）。图5-12 反馈阻遏模式图从模式图可看到，反馈阻遏模型中，操纵子的开关情况正好与诱导模型相反。反馈阻遏之所以可以同时反馈调节相关的几个酶，其原因即在于一条合成代谢途径中的几个酶的结构基因往往成串地分布在同一个操纵子上，或者尽管分散在不同的操纵子上，但这些操纵子受同一个调节基因编码的原阻遏物的控制，因而有协同作用。 如果对应于合成途径的操纵子的操纵基因发生突变或调节基因发生突变，使操纵基因的阻塞无法实现，那么该突变株就可以解除反馈阻遏，过量合成该途径的酶和终产物。这样的突变株可能在工业生产上应用。二、分解代谢产物阻遏分解代谢物阻遏（Catabolite repression）简称分解阻遏，在微生物代谢中普遍存在，即微生物在含有能分解的两种底物的培养基中生长时，首先分解快速利用的碳、氮源底物，而不分解慢速利用的碳、氮源底物。是微生物在长期进化过程中形成的一种重要代谢调节方式。1. 二次生长现象与葡萄糖效应 1942年Monod等研究大肠杆菌在同时含有葡萄糖和乳糖的培养基中的生长情况，出现了二次生长（diauxie）现象。即在第一阶段快速生长，大肠杆菌优先利用葡萄糖作为能源和碳源，当葡萄糖消耗完毕，细菌生长速度出现了一个下降的间隙（大约几分钟），然后又慢慢回升为第二阶段，此时它改用乳糖作能源和碳源，生长速度比第一阶段稍慢一些（见图5-13）。从细胞的分析发现，在第一生长阶段中，细胞内的-半乳糖苷酶活性很低。由此可见，细菌在利用葡萄糖时，乳糖操纵子的表达受限制；当葡萄糖耗尽时，生长明显下降，几分钟后，细菌开始利用乳糖生长，此时测得的-半乳糖苷酶活性要比第一阶段高得多。当时把这种葡萄糖干扰其他碳源利用的现象称为“葡萄糖效应”。随后的研究表明：葡萄糖效应并非由葡萄糖直接造成，而是其某种分解代谢产物所引起的。葡萄糖分解的某种产物阻遏了能够产生该物质的酶的合成，例如产气杆菌的组氨酸裂解酶将组氨酸分解为-酮戊二酸和氨，而葡萄糖也可以降解为-酮戊二酸，故能阻遏组氨酸裂解酶的合成。如果某种酶的作用产物没有与葡萄糖（或其它快速利用碳源）分解中间产物相同的物质，便不发生葡萄糖效应。随着分子生物学的发展，对其分子机制的阐明，1961年的一次生物学会议上正式定名为“分解代谢物阻遏”这个术语来代替“葡萄糖效应”这一俗称。图5-13 大肠杆菌在葡萄糖和乳糖混合碳源上的二次生长a靠葡萄糖生长，葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶的合成；b靠乳糖合成研究表明，分解阻遏并不仅限于葡萄糖，其它碳源和氮源（如NH4+、谷氨酰胺等）也能起相同作用。例如，固氮菌在NH4+存在时，固氮作用完全被阻遏。这种阻遏机制对微生物是很有利的，只要有一个容易同化的底物存在，细胞就不必耗费能量和原料去合成效率较低的途径的酶系，而使其代谢作用能更多地用于产生生长所必需的组分，因此，分解代谢物阻遏也是细胞经济的一个方面。2. 分解代谢产物的阻遏机制 对分解阻遏机制的研究证明，葡萄糖的作用不是影响其它碳源进入细胞，而是使细胞内缺少cAMP而引起的。R.S.Makman等（1965年）发现生长在葡萄糖上的大肠杆菌细胞内cAMP含量非常低（仅510-7mol/L），-半乳糖苷酶合成也很少；当葡萄糖耗尽后，cAMP浓度增高（达10-4mol/L），-半乳糖苷酶的合成显著提高。相反，若先将细胞培养在葡萄糖含量很少的培养基中，然后迅速加入葡萄糖，则发现葡萄糖的分解代谢产物对腺苷酸环化酶起抑制作用，而对磷酸二酯酶和cAMP透过酶起激活作用，从而造成cAMP被排出体外，体内cAMP骤减；当培养基液中同时含有葡萄糖与其它碳源时，体内cAMP含量介乎上述二者之间。由此可见培养基中葡萄糖含量与细胞内cAMP浓度有一定关系。如果在培养基中加入cAMP，能解除因存在葡萄糖而使-半乳糖苷酶受到抑制的现象。 乳糖操纵子的转录需要cAMP，因为cAMP与CRP（cAMP受体蛋白，cyclic AMP receptor protein；或称代谢产物活化蛋白，catabolite activator protein，CAP）形成的复合物可结合到乳糖操纵子的启动基因（P）部位，而且只有当发生这种结合时，乳糖操纵子才有可能被转录。这是因为cAMP和CRP的复合物能通过与某些操纵子的启动子结合而刺激转录，CRP与操纵子DNA的结合创造了一个新的供RNA聚合酶结合上去的位点的缘故。图5-14是根据大肠杆菌分解代谢物阻遏的事实编绘的模式图。图5-14 分解代谢物阻遏模式图当葡萄糖耗完时，cAMP浓度上升，它与CRP结合后一起去激活启动基因（P），提高RNA聚合酶与P的亲和能力，同时由于乳糖的诱导作用，乳糖操纵子的转录开始，从而诱导酶的合成。从图中看出，有CRP存在时，cAMP才能表现其正调节作用（即解除对诱导酶的阻遏），如果某突变株的CRP基因缺失或突变，因而没有正常的CRP产生，则对葡萄糖分解代谢阻遏的酶系不能起解阻遏作用。 在正常情况下，为受分解代谢物阻遏的酶系编码的操纵子的启动受cAMP-CRP复合物的调节。如果对应操纵子的启动子发生突变，使其与RNA聚合酶的亲和力大大增加，从而排除cAMP-CRP对诱导的调节作用。这样的突变株可能解除了分解代谢物阻遏。在生产实践上有时使用一些避免引起分解阻遏的物质，如青霉素发酵中常利用乳糖代替部分葡萄糖以提高青霉素产量；如培养基中必须添加引起分解阻遏的物质时，可采用分批添加或连续流加方式。三、酶活性的反馈抑制微生物的代谢调节控制解除了上述的调节合成酶量之外，还有调节已有酶活性的机制。酶活性调节是通过改变已存在的酶分子活性来调节代谢速度，包括酶活性的激活和抑制。能够激活的物质称为激活剂（activator），抑制酶活性的物质称为抑制剂（inhibitor）。 调节酶活力比调节酶的合成更迅速及时而有效，这是微生物饥饿情况下的一种经济的调节方式。通过改变代谢途径中一个或几个关键酶的活力，以影响代谢途径中各中间化合物的流量。这种活力调节通常由一特异的小分子代谢物（终产物等变构效应物）与酶的可逆性结合来进行。 在酶活性调节中，终产物对其合成途径第一个酶的活性产生抑制效应，叫做终产物抑制或者反馈抑制（feedback inhibition）。如图5-7所示，末端代谢产物从主代谢途径分出来，以其自己单独的代谢途径来抑制起初的酶1的酶活性，这样的功能叫做反馈抑制。受到反馈抑制的酶，由于其作用底物与起抑制作用的终产物，其化学结构完全不同，因此，不存在竞争性抑制关系。那么，为什么终产物过多时会抑制酶的活性，而在终产物浓度降低时，这种抑制作用又消失呢？Jacob和Monod等1963年提出了变构酶（allosteric enzymes）学说，从而解释了这种抑制作用机制。 研究认为，受反馈抑制的酶一般是变构酶（又称别构酶），酶活力调控的实质就是变构酶的变构调节。变构酶含有两条或两条以上的多肽链，具有至少两个立体专一性不同的结合位点：一个是活性部位（或活性中心，催化中心），是与底物结合的部位；另一部位称为变构部位或别构部位，与调节物（激活剂或抑制剂）非共价地可逆性结合的部位。酶的活性部位与变构部位处于不同的空间位置。酶与调节物（例如终产物）复合体的形成引起酶分子的三级或四级结构的可逆性变化，酶构型的变化影响了底物与活性中心的结合，从而影响酶的催化效应。终产物和酶的调节中心的结合是可逆的，因此当终产物的浓度降低时，终产物与酶的结合随即解离，从而恢复了酶蛋白的原有构象，使酶与底物可以结合而发生催化作用。变构酶的作用程序如下：专一性的代谢物（变构效应物）与酶蛋白表面的特定部位（变构部位）结合酶分子的构象变化（变构转换）活性中心的修饰抑制或促进酶活性。 由于反馈抑制使代谢链的第一个酶失去活性，因此其他的中间代谢产物也就不再被合成了。从利用能量的角度来看，这一点是最经济的，而且很有利用价值。在微生物的代谢活动中，三磷酸腺苷（ATP）是为许多反应提供能量的高能化合物。ATP释放出能量后转化为二磷酸腺苷