血浆一氧化氮水平与支气管哮喘的相关性研究.doc

论著Lunzhu中国医学创新第9卷第9期（总第219期）2012年3月血浆一氧化氮水平与支气管哮喘的相关性研究*陈嘉馨陆家政黎惠贞吴荣华杜一凡麦燕瑜臧林泉【摘要】目的：观察支气管哮喘患者血浆一氧化氮水平的变化，研究其与支气管哮喘的相关性。方法：将70例支气管哮喘患者分为哮喘缓解期组30例，轻度急性发作期组10例，中度急性发作期组12例，重度急性发作期组18例；正常对照组15例，采用硝酸还原酶法测定血浆一氧化氮水平并检测肺功能和测定诱导痰细胞的计数及分类。结果：支气管哮喘患者的血浆一氧化氮水平显著高于正常对照组(P0.01)，其中急性发作期组显著高于缓解期组(P0.01)，急性发作期组中轻度、中度、重度三者之间比较差异均有统计学意义(P0.01)。线性相关性分析显示，一氧化氮水平与支气管哮喘发作有相关性。研究对象所处的状态(健康、哮喘缓解期及哮喘发作期)与血浆一氧化氮水平明显相关(r=0.786，P0.01)。急性发作期患者血浆一氧化氮水平与FEV1.0%预计值(r=-0.872，P0.01)和诱导痰巨噬细胞百分比(r=-0.820，P0.01)呈负相关；与诱导痰细胞总数、中性粒细胞百分比及诱导痰嗜酸细胞百分比呈正相关(分别为0.857、0.816和0.825，P0.01)。结论：血浆一氧化氮水平升高，与支气管哮喘发生、发展相关，可能参与哮喘的发病，内源性一氧化氮作为一种无创性指标监测疾病的严重程度和活动度具有一定意义。【关键词】一氧化氮；支气管哮喘；诱导痰StudyontheEffectofthePlasmaLevelofNitricOxideonPatientswithAcuteAsthma/CHENJia-xin，LUJia-zheng，LIHui-zhen，etal./MedicalInnovationofChina，2012，9(9):6-8【Abstract】Objective：Toinvestigatetheeffectofnitricoxide(NO)onpatientswithasthma.Methods：LevelsofserumNO(nitratereductasemethod)，lungfunction，andcelldifferentialcountininducedsputumwerestudiedin40patientswithacuteexacerbationofasthma，30patientswithstableasthmaand15healthsubjects.Results：TheserumNOlevelwas(43.284.06)mol/Lincontrolgroup(15cases)，(56.303.07)mol/Linpatientswithstableasthma(30cases)，(65.572.38)mol/Linpatientswithmildofacuteexacerbationasthma(10cases)，(71.736.08)mol/Linthatwithmoderateofacuteexacerbationasthma(12cases)，and(87.367.15)mol/Linthatwithsevereofacuteexacerbationasthma(18cases).Statusofthesubjects(inhealth，stableasthma，andexacerbationofasthma)waspositivelycorrelatedwithNOinserum(r=0.786，P0.01).NOinserumwithsevereofacuteexacerbationasthmawasnegativelycorrelatedwithFEV1.0%(r=-0.872，P0.01)andthepercentageofsputummacrophages(r=-0.820，P0.01).Whileitwaspositivelycorrelatedwithtotalcountofsputumcells(r=0.857，P0.01)，thepercentageofsputumneutrophils(r=0.816，P0.01)andthepercentageofsputumeosinophiles(r=0.825，P0.05)，年龄情况各组的差异有统计学意义(P0.01)。所有研究对象均为非吸烟者，均获知情同意并签署知情同意书。NO测定试剂盒(Bioting-Tech公司)，亚乙烯二胺(sigma公司)，32.526、19.827，P0.05)。见表1。表1各组诱导痰细胞总数及分类计数(x-s)其余试剂为国产，分析纯。1.2方法1.2.1肺功能测定所有对象入选时采用肺活量计法测定组别诱导痰细胞总数(105/ml)中性粒细巨噬细胞嗜酸性粒胞(%)(%)细胞(%)淋巴细胞(%)(n=30)6.82.9*第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1.0%百分比)、FEV1.0/FVC及呼气峰流速(peakexpiratoryflow，PEF)。1.2.2血浆一氧化氮水平测定血浆NO含量的间接测定，硝酸还原酶测定法。因NO化学性质活泼，半衰期极短，迅正常对照组(n=15)3.91.7哮喘缓解期22.01.620.1211.21.428.85.7*45.56.3*8.93.6*13.35.3测定试剂盒，采用硝酸还原酶特异性地将NO还原为NO，速与分子氧反应生成NO2-和NO3-，故以血浆NO2-和NO3-之和检测NO的相对含量，应用Bioting-Tech公司提供的NO3-2-NO2-与显色剂亚乙烯二胺作用，生成粉红色偶氮化合物，通过比色测出NO2-/NO3-含量4。1.2.3诱导痰细胞计数分类参照文献5报道的方法进行：受试者测试肺功能FEV1.0FEV1.0pre的60%，可以进行痰液诱导，试验前受试者漱口后，吸入沙丁胺醇(万托林)400g，15min后开始超声雾化吸入4%(质量分数)的高渗盐水40ml，2040min后收集痰液，加入等量0.1%(质量分数)二硫苏糖醇(DTT)溶液，振荡至痰液完全均匀化开，取50l痰液注入细胞池作细胞计数，其余痰液在常温下3500r/min离心10min，取上清液分装，-80保存待测。离心沉渣涂片行瑞氏-吉姆萨染色作细胞分类计数一氧化氮胶囊。1.3统计学处理采用SPSS10.0统计软件进行统计学分析，数据以(x-s)表示，两组之间比较采用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析(F检验)，采用Pearson相关分析计算相关系数，以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1一般情况正常对照组FEV1.0%预计值为(89.76.5)，FEV1.0/FVC值为(81.78.5)，PEF%预计值(95.713.5)；哮喘缓解期组FEV1.0%预计值为(67.75.5)，FEV1.0/FVC值为(65.73.5)，PEF%预计值(69.819.5)；轻度急性发作期组FEV1.0%预计值为(58.77.2)，FEV1.0/FVC值为(59.67.5)，PEF%预计值(57.618.5)；中度急性发作期组FEV1.0%预计值为(50.74.9)，FEV1.0/FVC值为(52.85.3)，PEF%预计值(49.820.5)；重度急性发作期组FEV1.0%预计值为(40.74.8)，FEV1.0/FVC值为(48.87.8)，PEF%预计值(40.321.6)。各组的FEV1.0%预计值、FEV1.0/FVC值及PEF%预计值比较差异均有统计学意义(F值分别为23.132、25.012、21.025，P0.01)。2.2血浆NO比较健康对照组的血浆NO水平为(43.284.06)mol/L，哮喘临床缓解组为(56.303.07)mol/L，急性发作期轻度组为(65.572.38)mol/L，中度组为(71.736.08)mol/L，重度组为(87.367.15)mol/L，各组比较差异均有统计学意义(F=23.5，P0.101)。2.3诱导痰细胞计数分类诱导痰细胞总数、中性粒细胞百分比、巨噬细胞百分比及嗜酸性粒细胞百分比在各组之间的比较差异均有统计学意义(F值分别为8.753、21.856、MedicalInnovationofChinaVol.9,No.9Mar,2012轻度急性发作期组13.56.7*#37.82.8*#37.86.3*#10.32.7*13.82.9(n=10)中度急性发作期组16.93.6*#42.62.3*#30.65.7*#11.64.1*#12.98.6(n=12)重度急性发作期组20.74.1*#46.27.4*#25.75.7*#13.65.4*#13.13.7(n=18)F值8.75321.85632.52619.8270.461P值0.010.010.010.05*与正常对照组相比，P0.01；#与哮喘缓解期相比，P0.012.4相关性分析研究对象所处的状态(健康、哮喘缓解期及哮喘发作期)与血浆一氧化氮水平明显相关(r=0.786，P0.01)。急性发作期患者血浆一氧化氮水平与FEV1.0%预计值呈负相关(r=-0.872，P0.01)，与诱导痰细胞总数、中性粒细胞百分比及诱导痰嗜酸细胞百分比呈正相关(r分别为0.857、0.816和0.825，P0.01)，与诱导痰巨噬细胞百分比呈负相关(r=-0.820，P0.01)。3讨论支气管哮喘(简称哮喘)的发作是由于炎性细胞及某些结构性细胞释放的多种细胞因子和趋化因子组成的复杂网络，主要包括气道炎症、免疫与变态反应、气道神经调节以及遗传机制等，在内外因素的作用下，发生调控异常，导致炎症-上皮细胞-气道重塑-炎症加重的恶性循环，牵涉多种炎症介质及细胞因子。目前，合适的哮喘标志物及气道炎症介质的测定成为哮喘气道炎症研究新的热点课题。本研究表明，支气管哮喘组的血浆一氧化氮水平显著高于正常对照组，其中急性发作期组显著高于缓解期组，急性发作期组中轻度、中度、重度三者之间比较差异均有统计学意义(P0.01)。线性相关性分析显示，一氧化氮水平与支气管哮喘发作有相关性。与罗春玲6报道的一致。Ward等7通过实验发现，NO供体可明显抑制乙酰胆碱、组胺、白三烯D4所致的气道收缩，NOS抑制剂L-NAME可以减弱由于干冷空气、运动所引起的气道收缩，但不影响乙酰胆碱释放，提示NO有对抗乙酰胆碱收缩气道平滑肌的作用，cNOS来源的NO可以松弛气道平滑肌，对气道平滑肌调节发挥作用；但哮喘发作时，cNOS来源的NO生成减少，气道非肾上腺素能非胆碱能神经功能发挥不足，而iNOS活性大大增强导致-7-论著Lunzhu中国医学创新第9卷第9期（总第219期）2012年3月局部NO大量产生，当体内持续大量合成NO，在发挥免疫效应的同时也造成局部组织损伤。NO造成气道损伤的机理为，直接损伤气道组织细胞的DNA、线粒体及含铁酶类的活性，在气道内的特殊化学环境中和O2-形成过氧化亚硝酸(ONOO-)，与其他氮氧化物相互转变，形成NO2等高毒性物质。血浆中大量的NO更多表现为细胞毒性作用，致毛细血管后微静脉渗出增多，加重肺通气/血流比例失调及加重支气管痉挛。哮喘时，嗜酸性粒细胞会显著的升高已被公认，并与哮喘严重程度成正相关；它主要通过释放胞质中的主要碱基蛋白(MBP)、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)、嗜酸性粒细胞衍生性神经毒素(EDN)等毒性颗粒蛋白损伤靶器官，这些颗粒蛋白是造成哮喘特征性表现的主要原因之一8。哮喘气道炎症时，嗜酸性粒细胞释放NO的同时又促进嗜酸细胞的趋化，并抑制其凋亡，提示NO在哮喘嗜酸性粒细胞炎症中起着放大作用9。近年来的研究发现，在重度哮喘患者的气道组织、支气管肺泡灌洗液和痰液中中性粒细胞增多，它主要是其激活后释放IL-8、氧自由基(O2-)、胰肽酶等介质，对肺组织造成损伤，从而在哮喘的发生发展中发挥重要的作用10。NO主要存在中心粒细胞的胞浆中，当中心粒细胞被激活时，分泌到细胞外并随病情的严重程度而增加11，它主要引起肺基底膜的降解、黏液腺过度增生、黏液过度分泌、上皮细胞损伤等，在哮喘患者大量的黏液栓形成中起着重要作用。另外，NO还能刺激IL-8的产生，促进中心粒细胞的聚集，加重气道炎症。本研究结果表明，随着哮喘的严重程度，诱导痰细胞总数及中性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比升高，血浆一氧化氮水平明显升高，提示NO可能通过上述途径参与哮喘的慢性气道炎症过程，但仍需对此进行深入研究。本研究作为支气管哮喘发病机制的探究，尚有较多的局限性，认为一氧化氮的表达增高是导致哮喘炎症改变的形成和进展的重要原因之一，将为下一步研究如何增加cNOS的活性和/或选择性iNOS抑制剂的作用提供依据，可能为哮喘的治疗提供一个新的突破点。参考文献1RicciardoloFL.MultiplerolesofnitricoxideintheairwaysJ.Thorax，2003，58(2):175-182.2SapienzaMA，KharitonowSA，HorvathI，etal.EffectofInhaledL-arginineonExhaledNitricOxideinNormalandAsthmaticSubjectsJ.Thorax，1998，53(3):172-175.3中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南J.中华结核和呼吸杂志，2008，31(3):177-189.4张清友，杜军保，石琳，等.内源性一氧化氮与硫化氢在大鼠低氧性肺动脉高压中的相互作用J.北京大学学报(医学版)，2004，36(1):53-56.5GibsonPG，WlodarczykJW，HensleyMJ，etal.EpidemiologicalassociationofairwayinflammationwithasthmasymptomsandairwayhyperresponsivenessinchildhoodJ.AmJRaspCryptCareMed，1998，158(1):36-41.6罗春玲，邹晨容.哮喘患者血浆一氧化氮变化的临床意义J.中国医学创新，2010，7(29):35-36.7PhilipE.ATSWorkshopproceedings:exhalednitricoxideandnitricorideoxidativemetabolisminexhaledbreathcondensateJ.ProcAmThoracSoc，2006，173(7):131-145.8ParkYJ，OhEJ，ParkJW，etal.Plasmaeosinophilcationicprotein，interleukin-5，andECP/EocountratioinpatientwithvariouseosinophilicdiseasesJ.AnnClinLabSci，2006，36(3):262-266.9LexC，FerreiraF，ZacharasiewiczA，etal.Airwayeosinophiliainchildrenwithsevereasthma:predictivevaluesofnoninvasivetestJ.AmJRespirCr