实验十三细胞凋亡的检测.ppt

细胞生物学实验之实验十三 细胞凋亡的检测 南开大学生命科学学院 二零零七年六月 实验目的 细胞凋亡的检测 了解细胞凋亡的检测方法 加深对细胞凋亡现象及本质的理解 练习从形态学角度评价细胞凋亡 掌握荧光显微镜的使用方法 细胞凋亡的检测 实验原理 基本概念 细胞凋亡 Apoptosis 是指细胞基因调控的一种自主性的自杀现象 或者说在一定的生理或病理条件下 细胞遵循自身的程序 自我结束生命的死亡方式 由于这种死亡方式是由基因调控的死亡过程 因此又称之为程序性细胞死亡 ProgrammedCellDeath 细胞凋亡有别于细胞坏死 似秋叶的凋零 告别生命之辉煌 那难以计数的攻击 诱导 轻启着道道程序 逼细胞步步走向生命的末端 啊 活性氧处处肆虐 钙波涛惊石裂岸 线粒体把生命之光一点一点拧淡 危难中的细胞啊 你沉稳不乱 DNA片片切割 化云梯直通天堂 细胞体分团相聚 把生命的凝重浓集在小体上 分别了朝夕相处的伙伴 再见了快乐美好的时光 这一切的一切又融入临近的胞体 腾出的空间再写生命的篇章 细胞凋亡与细胞坏死的区别 坏死凋亡 1 性质 2 诱导因素 强烈刺激 随机发生 较弱刺激 非随机发生 3 生化特点 4 形态变化 6 DNA电泳 5 炎症反应 7 凋亡小体 8 基因调控 被动过程 无新蛋白合成 不耗能 主动过程 有新蛋白合成 耗能 细胞结构全面溶解 破坏 细胞肿胀 胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩 核固缩 弥散性降解 电泳呈均一DNA片状 DNA片段化 180 200bp 电泳呈 梯 状条带 溶酶体破裂 局部炎症反应 溶酶体相对完整 局部无炎症反应 有 病理性 非特异性 生理性或病理性 特异性 无 有 无 细胞凋亡的形态特征 1 凋亡的起始 微绒毛的消失 细胞间接触的消失 与周围的细胞脱离 细胞质中 线拉体大体完整 染色质固缩 2 细胞质密度增加 线粒体膜电位消失 通透性改变 释放细胞色素C到胞浆 膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面 3 凋亡小体的形成 核膜核仁破碎 核染色质断裂为大小不等的片段 与某些细胞器如线粒体一起聚集 为反折的细胞膜所包围 4 凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬 细胞凋亡的形态学特征 细胞凋亡与疾病 细胞凋亡不足 肿瘤 自身免疫病细胞凋亡过度 心肌缺血 心力衰竭 神经元退行性疾病 病毒感染 细胞凋亡检测方法 基于形态学观察的染色法 基于DNA片断化的检测法 膜联蛋白检测法 Caspase酶分析法 流式细胞仪定量分析法 细胞凋亡的检测 实验原理 细胞凋亡的检测 实验仪器 材料及试剂 1 仪器 用具 荧光显微镜 显微载玻片 盖玻片 微量 2 培养的细胞材料 HeLa细胞 3 试剂 吖碇橙 溴化乙锭 AO EB 的PBS溶液 PBS溶液中分别加入100 g mL的AO与100 g mL的EB 配成两种溶液 用时再混合 磷酸盐缓冲液 PBS 800mL蒸馏水中溶解8gNaCL 0 2gKCL 1 44gNa2HPO4 0 24gkH2PO4 用盐酸调pH到7 4 加水定容到1L 高压灭菌保存 移液器 高压灭菌锅 细胞培养用具 细胞凋亡的检测 实验步骤 1 Hela细胞贴壁生长于DMEM培养液中含10 胎牛血清 置37 5 CO2培养箱中培养2 3天 待细胞形成单层融合状态 2 去细胞培养液 加入0 215mol L双氧水的10 胎牛血清培养液中 继续培养24 36小时 3 收集细胞 用细胞消化液消化细胞使细胞脱壁 制成单细胞悬液 1000Xg离心力离心5分钟 弃上清 4 取25 l培养的细胞悬液滴于载玻片上 稍风干后 加入AO EB1 1混合液染色 并盖上盖玻片 5 荧光显微镜下观察 细胞凋亡的检测 注意事项 1 EB为强诱变剂 使用时要注意防护 2 试剂与细胞孵育完毕后 要立即检测 3 正确使用显微镜 保护好镜头和滤光片 细胞凋亡的检测 课后作业及思考 1 练习用AO EB法检测凋亡的细胞 掌握荧光显微镜的使用 2 查阅相关文献 理清细胞凋亡与细胞坏死的区别 3 了解其它可用于细胞凋亡检测的方法及其原