生物化学实验二：DNA的琼脂糖凝胶电泳.doc

生物化学实验二：DNA的琼脂糖凝胶电泳指导教师：李玉芹 一、目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。二、 原理 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小 在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度 一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压 低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度 DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4与30之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4条件下电泳。 (5) 嵌入染料 荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。 对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等，一般配制成浓缩母液，室温保存，用时稀释。三、主要仪器 1. 恒温培养箱 2. 琼脂糖凝胶电泳系统 3. 微波炉 4. 紫外线透射仪四、试剂 1.三羟甲基氨基甲烷（Tris） 2.硼酸 3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚蓝 5.蔗糖 6.琼脂糖 7.溴化乙锭 8.DNA marker 9.DNA样品五、实验步骤1.缓冲液的配制 5TBE(5倍体积的TBE贮存液) 配1000ml 5TBE: Tris 54g硼酸 27.5g0.5mol/l EDTA 20ml Ph8.0 凝胶加样缓冲液(6)溴酚蓝 0.25%蔗糖 40%溴化乙锭溶液(EB) 0.5g/ml2.制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度 线性DNA的有效分离范围 0.3% 5-60 kb 0.6% 1-20 kb 0.7% 0.8-10 kb 0.9% 0.5-7 kb 1.2% 0.4-6 kb 1.5% 0.2-4 kb 2.0% 0.1-3 kb3.胶板的制备 (1) 用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘（或电泳装置所皿备的塑料盘的开口）封住，形成一个胶膜（将胶膜放在工作台的水平位置上，用水平仪校正）。 (2) 配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液（1TBE）。准确称量的琼脂糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的50%容量。 在电泳槽和凝胶中务必使用同一批次的电泳缓冲液，离子强度或pH值的微小差异会在凝胶中形成前沿，从而大大影响DNA片段的迁移率 。 (3) 在锥瓶的瓶颈上松松地包上一层厚纸。如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。在沸水浴或微波炉中将悬浮加热至琼脂糖溶解。注意：琼脂糖溶液若在微波炉里加热过长时间，溶液将过热并暴沸。应核对溶液的体积在煮沸过程中是否由于蒸发而减少，必要时用缓冲液补充。 (4) 使溶液冷却至60。加入溴化乙锭（用水配制成10mg/ml的贮存液）到终浓度为0.5ug/ml，充分混匀。 (5) 用移液器吸取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，凝固后，在距离底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距玻璃板太近，则拔出梳子时孔底将有破裂的危险，破裂后会使样品从玻璃板之间渗透。 (6)将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。凝胶的厚度在3-5mm之间。检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。 (7)在凝胶完全凝固后（于室温放置30-45分钟） ，小心移去梳子和高压灭菌纸带，将凝胶放入电泳槽中。 低熔点琼脂糖凝胶及浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶应冷却至4，并在冷库中电泳。(8)加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。4加样 DNA样品与所需加样缓冲液混合后，用微量移液器，慢慢将混合物加至样品槽中。此时凝胶已浸没在缓冲液中。 一个加样孔的最大加样量依据DNA的数量及大小而定，一般为10-20l样品。已知大小的DNA标准，应同时加在凝胶的左凝胶的左侧和右侧孔内。确定未知DNA的大小。测量未知DNA的大小时，要所有样品都用相同的样品缓冲液。5电泳在低电压条件下,线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系,但是,在电场增加时,不同相对分子质量的DNA片段泳动度的增加是有差别的。因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围随之减小。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率