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From:遗传密码Western Blotting Review摘要：本文主要是针对Western bloting的原理及操作进行了简单的阐述，Western印迹法是利用抗原抗体的免疫反应，先将蛋白通过SDS-PAGE电泳分离开来，然后再利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体（NC膜）上，然后再加抗体形成抗原抗体复合物，利用发光或显色原理将结果显示到膜或底片上。同时对Western bloting在实际操作中应注意的细节问题进行了归纳以及与其它免疫技术就抗体检测方面进行了比较。关键词：Western bloting；免疫；转膜；显色；抗体印迹法(bloting)是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质印迹分析称为Western印迹法（Western bloting），对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。一、Western bloting的原理 Western bloting首先是要将电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到NC膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片NC膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到NC膜上，NC膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。但是这种方法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质（10%-20%）。而电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和NC膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到NC膜上。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。与湿转相比，这种方法要快（15-45 分钟）。 转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗体特定IgG的抗体（二抗）可以直接购买，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以将H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺并发光，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测出辣根过氧化物酶的存在，即目标蛋白质的存在了。除了酶连二抗作为指示剂，也可以使用其它指示剂，比如：荧光素异硫氰酸盐标记的二抗（可通过紫外灯产生荧光）；生物素结合的二抗等等。除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外，有时也使用其它探针如放射性标记的DNA，可以检测印迹中的DNA结合蛋白。 在Western bloting实验中，有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色。这种方法叫直接法，与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都釆用间接法进行检测。二、Western bloting的操作(间接法)1、蛋白质样品（抗原）的制备：细胞的处理方法：向收集到的细胞中加入RIPA裂解缓冲液（三中蛋白酶抑制在使用前加入，终浓度为2ug/ml）在冰上裂解3060min，然后再插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次，再离心12000rpm3-5min，吸取上清备用。（超声强度不能过大，防止蛋白碳化）组织的处理方法：按实验要求将组织从动物体内取出（样品不宜反复冻融），取少量（1-2g左右）放入玻璃匀桨器中研磨成匀浆，然后转入EP管中进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次5-7秒，重复5-6次，再离心12000rpm3-5min，吸取上清备用。上述两种方法得来的样品处理液还要加入1/4体积左右的上样Buffer，然后放在沸水浴中加热3-4min使蛋白变性，方可作为样品点样。（注意：在加热组织裂解液时，肝脏和肾脏组织要特别注意其本身浓度，最好是在制作裂解液时就适当稀释，否则加热后会凝结成固态。还有些组织处理后很粘稠，有带丝状物，这是未裂解的核酸，可以适当离心后再用。）2、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDSPAGE）根据要求配制好SDS-聚丙烯酸胺凝胶（一般釆用10%的SDSPAGE）将已配制好的凝胶装入电泳仪中（注意不要漏液）。设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样。一般裂解液我们按10-20ul/道点样，重组蛋白按1-2ug/道点样。把电泳装置与电源连接好，将电压调至100V电泳10-20min，待溴酚蓝迁移出积层胶位置再换用200V，30-40min后关闭电源。从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用水冲洗干净，准备转膜。4转膜（湿转） 将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡几分钟。 带上手套，准备好滤纸和NC膜（83mm75mm），尽量避免污染滤纸和膜，将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，驱除留于膜上的气泡。 打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的滤纸。 按“海绵滤纸凝胶NC膜滤纸海绵”的顺序装置好（注意不能有气泡且装置电极槽不能放反）将冰盒装入缓冲液槽，注满4预冷的转移缓冲液。将整个装置放在冰浴中用磁力搅拌器搅拌，连接好转移电极恒流300mA转移90min。电转完毕后，将NC膜作好记号置于5%的脱脂奶粉（PBS配制）中封闭，372小时或4过夜。5加一抗与抗原结合将加样槽洗涤干净，将膜用一次性手套覆盖好，按标记和实验设计切下膜条并作好记号，按顺序置于加样槽中加入相应的一抗约1ml，注意保证膜的所有部分同溶液接触。室温下于摇床孵育2h或4过夜。弃去一抗，膜条仍置于加样槽，每个槽中的膜用PBST在摇床洗涤洗涤5min左右 ，换液，反复4-5次。6加二抗与一抗的结合 根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度（PBS稀释），每个加样槽中加入二抗1ml左右室温下于摇床孵育1h，注意保证膜的所有部分同溶液接触。弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加PBST在摇床洗涤洗涤5min左右，换液反复4-5次。7显色反应（重组蛋白一般用AP显色或是DAB显色，裂解液一般用发光法） HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存AKP标记二抗用AP显色，在10mlAKP缓冲液中加入66µlNBT溶液和33µl BCIP溶液混匀，室温下将膜放入显色（37可加速反应）5-15min。对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。（荧光在一段时间后会越来越弱要控制好时间）三、Western bloting要注意的一些问题内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。1、为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳性对照（最好有标准品（比如-actin，GAPDH）或阳性血清）；阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；空白对照（不加一抗，用PBS代替）；无关对照（用无关抗体）2、一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。3、实验设计时所釆用的抗原批次要一样，尽量的避免人为的带来个体差异。特别在做裂解液时更要注意所釆用的操作条件，尽可能的排除可变因素给实验带来不确定性。4、凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。5、电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时“三明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气泡；尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。6、封闭时一般在室温下2h就够了，但是要注意如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。7、加一抗二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。8、在显色发光时要特别注意二抗所对应的显色方法，特别是在发光时要注意发光时间和显影时间的控制，以看得清楚目的条带为标准。Western印迹法这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、20低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10分离胶、4浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（2020cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/L TrisHCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH HCl 7.4 约17ml 7.5 约16m 7.6 约15ml8.0 约10ml1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g 异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，20保存。0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（MW119.98） 12g 蒸馏水至 500ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO412H2O（MW 358.14） 71.6g蒸馏水至 1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。10SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml50水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10过硫酸胺（AP）过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml溶解后，4保存，保存时间为1周。1.5mol/L TrisHCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。0.5mol/L TrisHCl（pH6.8）Tris (MW121.14) 15.14g 超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。40Acr/Bic（37.5：1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g超纯水至 100ml37下溶解后，4保存。使用时恢复至室温且无沉淀。20Tween20Tween20 20ml蒸馏水至 100ml混匀后4保存。（二）使用液单去污剂裂解液（50mmol/L TrisHCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1TritonX100，100mg/ml PMSF）： 1mol/L TrisHCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTritonX100 0.5ml蒸馏水至 50ml 混匀后， 4保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100mg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50l）。0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）0.2 mol/L NaH2PO4 19ml0.2 mol/L Na2HPO4 81mlNaCl 17g蒸馏水至 2000mlG250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用） 考马斯亮蓝G250： 100mg 95乙醇： 50ml 磷酸： 100ml 蒸馏水至 1000ml 配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4保存。0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g 蒸馏水至 100 ml高温灭菌后，室温保存。100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g 0.15 mol/L NaCl 1ml溶解后，20保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，20保存。10分离胶和4浓缩校 10分离胶（两块胶，10ml） 4浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水 4.85ml 3.16ml40Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml1.5 mol/L TrisHCl（pH8.8） 2.5ml 0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8） 1.26ml10SDS 100 ml 50 ml10%AP（过硫酸胺） 50 ml 25 mlTEMED 5 ml 5 ml 加TEMED后，立即混匀即可灌胶。还原型5XSDS上样缓冲液（0.25mol/L TrisHCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10 SDS，0.5溴酚蓝，50甘油） 0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8） 2.5ml 二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g SDS 0.5g溴酚蓝 0.025甘油 2.5ml 混匀后，分装于1.5ml离心管中，4保存。电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1 SDS） Tris（MW121.14） 3.03g 甘氨酸（MW75.07） 18.77gSDS 1g蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存，次溶液可重复使用35次。转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037 SDS，20甲醇）甘氨酸（MW75.07） 2.9gTris（MW121.14） 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml蒸馏水至 1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用35次。10X丽春红染液丽春红S 2g三氯乙酸 30g磺基水杨酸 30g蒸馏水至 100ml使用时将其稀释10倍。TBS缓冲液（100mmol/ L TrisHCl pH7.5,150mmol/L NaCl）1 mol/ LTrisHCl（pH7.5） 10mlNaCl 8.8g蒸馏水至 1000ml TBST缓冲液（含0.05Tween20的TBS缓冲液） 20Tween20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用，最好现用现配。1*TBST 1LTris base 2.422g (MW121.4)Nacl 8.775gTween20 0.5ml封闭液（含5脱脂奶粉的TBST缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌） 5g TBST 100ml溶解后4保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。洗脱抗体缓冲液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2SDS，62.5m mol/L TrisHCl pH6.8）14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(-巯基乙醇) 700 ml（通风厨里加） SDS 2g 0.5mol/L TrisHCl（pH6.8） 12.5ml 超纯水至 100ml配制时，在通风厨内进行。4保存。可重复使用1次。显影液（5X） 自来水（加热至50） 375ml （以下药品加到温水中） 米吐尔 1.55g 亚硫酸钠（无水） 22.5g 碳酸钠（无水） 33.75g 溴化钾 20.95g 补水至 500ml配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4保存。使用时用自来水稀释至1倍。定影液自来水（5060） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸钠 240g亚硫酸钠（无水） 15g冰乙酸 12.6ml硼酸 7.5g钾明矾 15g（水温冷至30以下时再加入）加水定容至1000ml，室温保存抗体 用TBST稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml化学发光试剂购自北京中山公司，为Santa Cruz产品，分A和B两种试剂。操作步骤：（一） 蛋白样品制备（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、 每瓶细胞加3ml 4预冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3、 按1ml裂解液加10 ml PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4、 每瓶细胞加400 ml含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6、 于4下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）7、 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于20保存。（2） 组织中总蛋白的提取：1、 将少量组织块置于12ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。2、 加400 ml单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。3、 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。4、 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于20保存。（3） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1、 将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。2、 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。3、 用枪洗干上清后，加100 ml裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。4、 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于20保存。（二） 蛋白含量的测定（1） 制作标准曲线1、 从20取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。2、 取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0mg，2.5mg，5.0mg ，10.0mg ，20.0mg ，40.0mg。3、 按下表在各管中加入各种试剂。0mg2.5mg5.0mg10.0mg20.0mg40.0mg1mg/ml BSA2.5ml5.0ml10.0ml20.0ml40.0ml0.15mol/L NaCl100ml97.5ml95.0ml90.0ml80.0ml60.0mlG250考马斯亮蓝溶液1ml1ml1ml1ml1ml1ml4、 混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（BioPhotometer，Eppentoff）上比色分析。5、（2） 检测样品蛋白含量1、 取足量的1.5ml离心管，每管加入4储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。3、 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。4、 取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5ml待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 ml样品含的蛋白量。（三） SDSPAGE电泳（1） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。（2） 灌胶与上样1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）2、 按前面方法配10分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。4、 按前面方法配4的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）6、 测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5SDS 上样缓冲液至终浓度为1。（上样总体积一般不超过15ml，加样孔的最大限度可加20ml样品。）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。7、 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。（3） 电泳电泳时间一般45 h，电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。（四） 转膜（1） 转一张膜需准备6张7.08.3cm的滤纸和1张7.38.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水）。（2） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。（3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）（5） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2 h或40V转移3 h。（6） 转完后将膜用1丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。 （五） 免疫反应（1） 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。（2） 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育12h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。（3） 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育12h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。（六） 化学发光，显影，定影（1） 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。（2） 在暗室中，将1显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为12min（2025），温度过低时（低于16）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为510min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。（七） 凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。 Western blot analysis-1 Cells were cultured in 199 medium with 10% fetal bovine serum. After digestion with 0.25%trypsin and 0.2%EDTA, the cells were collected and were washed three times with ice-cold PBS, then were lysed in buffer(50mM Tris-HCl, pH8.0,150mM NaCl, 100g/ml PMSF, 1%TritonX-100) for 30 min at ice. After removal of cell debris by centrifugation(12,000g,5 min), the protein concentration of lysates was meatured by Bradford method. 50g proteins of different groups boiled for 5 min in sample buffer and were separated in 10% SDS-PAGE and transferred onto nitrocellulose membrane (Bio-Rad). Nonspecific reactivity was blocked by incubation overnight at 4 in buffer(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 2%Tween-20, 4% bovine sreum albumin).The membrane was then