乙型肝炎病毒(HBV)实时荧光定量PCR.doc

乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR目的要求掌握 血清中HBV-DNA的提取方法及原理；HBV-DNA实时荧光定量PCR的测定原理； HBV-DNA实时荧光定量PCR实验操作及结果分析了解 核酸测定引物设计原理；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作。教学时数讲授2学时，实验6学时。讲授内容血清中病毒DNA的提取方法和原理；实时荧光定量PCR的测定原理；核酸测定引物设计原理；HBV-DNA测定引物设计思路；HBV-DNA荧光定量PCR试剂组成、相应作用及反应混合液配制；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作实验内容分组提取血清中HBV-DNA；配制反应液并上机操作，实时观察，结果分析；实验结果讨论；实验总结自学内容“感染性疾病的分子诊断”实验指导（自编） 实验 乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR【原理】Real time PCR 是普通PCR 的一项改进，使用了针对扩增DNA 的荧光物质，使得DNA的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA 的扩增曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。即对DNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测。该方法精确、灵敏、特异性强、污染途径小、自动化程度高、操作简单。是国际公认的核酸分子定量的标准方法。它已逐渐代替了Northern blotting 以及semi RT-PCR技术。本实验从HBV携带者或者乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因组DNA，采用核酸扩增结合TaqMan荧光探针技术, 利用一对乙肝病毒特异性引物和一特异性结合于扩增区另一位点的TaqMan探针, 实现对乙肝病毒模板的扩增和检测。使用商品化试剂盒：HBV实时荧光定量试剂盒，深圳匹基公司（PG，Biotech.）。针对表面抗原S基因，设计一对引物和一个探针。TaqMan荧光探针技术中，两个荧光染料标记在探针上，一个叫报告基团（R），一个叫淬灭基团（Q）。当两个荧光基团都连在探针上时，报告基团的荧光被淬灭基团抑制。在延伸中，DNA聚合酶利用53外切酶活性把报告基团从探针上切下来。一旦和淬灭基团分开，报告基团释放出荧光。通过监测荧光信号的积累来反映乙肝病毒DNA的扩增.产物的积累，根据扩增反应的动力学特征使用外部标准曲线对初始模板定量（图4）。 图4：TaqMan荧光探针技术原理 R:荧光报告基团 Q：荧光淬灭基团【试剂与器材】1HBV-DNA检测试剂盒：DNA提取液1，DNA提取液2，PCR预混合液（含有Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dUTP、dGTP、dCTP引物、荧光标记的探针）、Taq酶、UNG，强阳性对照血清、阴性对照血清、临界阳性血清，四种不同浓度的阳性参控品、双蒸去离子水。2荧光定量PCR仪3PCR反应管4移液器及移液器吸头5高速离心机6漩涡混合器7超净工作台8调温电热板【操作步骤】1. 试剂和主反应混合物的准备：从试剂盒中取出HBV PCR反应液、Taq酶及UNG。室温融化后，2000rpm离心10sec，设需要的管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管室内质控+1管试剂空白+4管阳性参控品），40ul测试反应体系配制如下表：试剂PCR反应液Taq酶UNG用量37.6ul0.4ul0.06ul计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向设定的n个PCR反映管中分别加入38ul，转移至样本处理区。2. 样本的制备和上样（1）标本处理取n个0.5ml灭菌离心管，做好标记。首先加入100ulDNA提取液1，再分别加入待测血清或血浆样本（切勿吸入血细胞）以及各种对照品各100ul，振荡混匀，13000rpm离心10min：吸弃上清（离心时注意固定离心管方向，尽可能吸弃上清且不碰沉淀）；再加入25ulDNA提取液2，振荡10sec（沉淀无需打散、混匀），100干浴，13000rpm离心10min，保留上清备用。如果样本裂解产物当天不使用，则要保存在-20。（2）上样若样本及对照品裂解产物保存在-20，使用前置室温解冻，以13000rpm离心5min。在所设定的n个反应管中分别加入步骤1中处理过的样本、阴性对照、强阳性对照和室内质控血清、灭菌去离子水以及阳性参控品各2ul，盖紧PCR反应管管盖，并记录样本信息。3. PCR上机扩增检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器；检查并消除反应管底气泡。按设置装载反应管，选择或设置扩增和检测条件：选择预设的程序文件或设置为：370C：3min；940C：1min；950C：5sec，600C：30sec，40个循环，荧光信号收集设在600C。设置模板：设置孔位及荧光（详见相应仪器的操作手册）。保存数据文件并运行。4. 结果分析（1）设置分析条件：设定基线：不同的PCR仪操作略有不同，按仪器说明书操作。PE7700:分析前把标准荧光定为TAMRA。如果没有Ct16的强阳性样品，应选315个循环的平均荧光信号作为基线再分析Ct；如果有Ct16的样品，则将此样品定为强阳性，并将此样品从数据库中剔除，然后以315个循环的平均荧光信号作为基线再分析Ct。ICycler：基线一般取自设值（210）。实验结束后，点击PCR baseline subtract选项扣除基线值。若某些曲线出现无规则的起伏跳动，应视为非正常现象，此时将其从结果中剔除（点击select wells,消除此孔彩色，然后选择display wells）。注意调整坐标，使所有曲线都在坐标内，见图5。LightCycler：用荧光显示模式F1/F2读取结果。基线设定原则以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值不出现任何数值时为准（一般定在0.0010.01范围内，也可以根据仪器本身的实际情况加以调整）。域值设定：以刚好高于阴性对照品的扩增曲线最高点，且阴性对照品Ct=40或Ct=0为原则，调整起始域值。（2）实验有效性判断：检查质控和标准品应同时符合下列条件，见图5：（否则试验视为无效）阴性对照、试剂空白CT值都为0强阳性对照和室内质控CT值不为0，且强阳性小于室内质控，拷贝数在105107间。标准品CT值小于38，且标准曲线斜率在-3.5 -4.0间，截距在40 50间，相关系数小于-0.98。A.B.图5 实时荧光定量PCR结果分析E8, F8, G8, H8为标准品，D8为待测样本，C8为阴性对照；A：基线、域值设置， B.：标准曲线5. 检测结果的报告：检测样本中103copies/ml HBV DNA 5107copies/ml，可直接报告相应的拷贝数；检测样本中HBV DNA 103copies/ml时，均报告为 103copies/ml。检测样本中HBV DNA 为 0copies/ml时 ，报告为 5107copies/ml时，均报告为 5107copies/ml【注意事项】1操作中应使用不含荧光物质的一次性手套（经常更换）、一次性吸头（最好带滤芯），并不能用手直接接触扩增管。2操作台、离心机、移液器、PCR扩增仪等应定期用10%次氯酸钠或70%酒精擦拭去污染。3荧光探针应避光保存，配制好反应液体系，应尽快上机扩增。4配置反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有液体的混匀要使用振荡器进行，不能用移液器吹打。5所有试剂开盖前，应短暂离心。6配制反应体系过程中若需标记，请在试管或离心管架上标记，不要直接标记在扩增管上。【思考题】通常PCR有典型的变性-退火-延伸三个温度点，为何本实验扩增温度循环只有两温度点：950C：5sec，600C：30sec，40个循环 ？1.一般典型阳性的扩增曲线有对数生长期（荧光信号呈指数上升，曲线平直且有一定斜率），以及平台期（荧光信号无明