结核病免疫学诊断新进展.ppt

河南省胸科医院中心实验室张国龙 结核病免疫学诊断新进展 March24 2004 WorldTBday WouldyoumindtocleanthisDirtyairbyyourlung 结核病人的全球分布 结核菌形态学改变正常结核菌 FIG 1 EffectofanaerobiccultureonthemorphologyofM bovisBCG M tuberculosis andM smegmatis A LongitudinalsectionofanM bovisBCGbacillusculturedanaerobicallyfor6monthsshowingpronouncedcellwallthickening somecytoplasmicdehydrationisevident B TransversesectionsofM bovisBCGbacilliculturedanaerobicallyfor6months C Lackofcellwallthickeninginlow ODaerobicallyculturedM bovisBCGbacilli D NLSPCM bovisBCGbacillishowingtheabsenceofcellwallthickening EandF CellwallthickeninginM tuberculosisfollowinganaerobicculturefor1monthundermineraloil G AerobicallyculturedM smegmatis H M smegmatisbacilliexhibitingcelllysisfollowing35daysofanaerobicculture 细胞壁增厚 37c 4monthswithoutshakinginaloosecapedTube 细菌变小 呈颗粒状或椭圆状 人体免疫 结核性肉牙肿模型 ESAT 6抗原的研究开发 课题进展报告 一 课题立项背景和意义 课题 年 月立项 获卫生人才科技创新项目经费资助 万元 全球结核病疫情 感染人数2 亿年新增加患病人数8 万年结核病死亡人数 万 中国结核病疫情 2000全国流调感染率44 5 结核患病率367 10万涂阳患病率122 10万估计全国有结核病人 万TB Averagedeathage55 2Y 结核病诊断的冰山现象 感染人群 活动性病人 总人口 大量病人的诊断需要依靠结素试验 存在的主要问题 PPD不能区分卡介苗接种和结核菌感染 我国卡介苗接种率超过 存在有大量过诊过治现象TB Averagedeathage55 2Y 年结核菌全基因测序的公布 为新诊断试剂的开发带来了希望 BCG在传代过程中删除了ESAT 6等基因 也就意味着 用它作诊断试剂 可以排除卡介苗接种的干扰 BCG ESAT 6CFP10 RD1区 TB 二 课题已经取得的进展 一 利用转基因技术 表达和纯化出了ESAT 6蛋白 二 动物实验三 人体试验 一 利用转基因技术 表达和纯化出了ESAT 6蛋白 质粒构建 ESAT 6基因插入 Vector pQE30 Primer 5 TTGGGATCCATGACAGAGCAG 3 5 ATAAAGCTTCTATGCGAACATCC 3 PCRampliWcationsweredonewith35cyclesat94 Cfor1min 66 Cfor1min and72 Cfor1min followedbyaWnalextensionstepat72 Cfor2min 一 利用转基因技术 表达和纯化出了ESAT 6蛋白 2 筛选克隆 一 利用转基因技术 表达和纯化出了ESAT 6蛋白 3 大量培养转基因大肠杆菌 度封闭式摇床 一 利用转基因技术 表达和纯化出了ESAT 6蛋白 蛋白分离与纯化系统 P10纯化柱 粉碎用硅酸粉 NI你NAT分离柱 一 利用转基因技术 表达和纯化出了ESAT 6蛋白 纯化出ESAT 6蛋白 一 利用转基因技术 表达和纯化出了ESAT 6蛋白 SDS蛋白表达确认 ESAT 6蛋白分子量约为 KD 二 动物实验 小鼠品系 I CR感染途径 H37Rv或 BCG104CFU尾缘静脉内注射皮肤试验 感染四周后 PPD5u和ESAT 6蛋白2微克下肢脚垫内注射 以脚肿张直径为判断标准 动物模型 二 动物实验 实验结果 PPDESAT 6PPDESAT 6 10 8 6 4 2 mm ESAT 6在结核菌和卡介苗感染组皮试结果有明显差异 H37Rv BCG 三 人体试验 文献报道 活动性结核皮试结果和干扰素水平有正相关 三 人体试验 2 外周血培养诱导干扰素实验操作程序 三 人体试验 PPDESAT 6PPDESAT 6 志愿者皮试及外周血培养试验 皮试 干扰素测定 用于皮试结果阳性率较低 三 人体试验 志愿者皮试及外周血培养试验 PPD强阳性 例 PPD强阳患者中ESAT 6诱导干扰素阳性率 四 研究结论 ESAT 6不能用于皮肤试验 因为人体试验显示了较低的阳性率 因为特异高 敏感性就低 外周血培养 诱导干扰素实验 显示了良好的相关性 临床主要适用于菌阴结核病人的诊断 与PPD实验相比 可以缩短诊断时间 减轻病人痛苦 提高正确诊断率 避免过诊过治 三 课题的将来研究计划 课题以开发试剂盒为目的 为避免技术泄密 不提倡发表论文 继续扩大实验样本 稳定实验条件 EL ISA试剂盒 存有成本高 价格贵的缺点 难以在基层推广 我们希望与其他单位联合 进一步开发出操作简单 价格便宜的诊断试纸条 以便大面积推广使用 StudyonProinflammatoryandTh1 Th2CytokinesinTuberculosisCases ZHANGGuolong1 2MITSUYAMAMasao2DUChangmei1SHIRuiru1WANGJiangdong1GAOFeixu1XIEHongge1 1HenanAnti TuberculosisInstitute Zhengchou Henan China2DepartmentofMicrobiology KyotoUniversitySchoolofMedicine Japan BACKGROUND CytokinesproducedbymacrophagesandTcellsarebelievedtobeinvolvedinbothpathophysiologyanddiseaseoutcomeinhumantuberculosis Amongvariouscytokines interferongamma IFN g appearstobethemostessentialonefortheresolutionofthedisease IFN gproductionisunderthecontrolofIL 12andIL 18releasedfromthecellsofmacrophagelineage Th1 Th2balanceisbelievedtobeimportantfortheresolutionoftuberculosis Pneumonia tuberculosisandtumorarethreemajordiseasesinlung sometimestheirx rayshadowsandsymbolsarequitesimilar somecytokinesmightbeusefulfordifferentialdiagnosisThecytokinelevelsintheclinicalspecimenhavenotbeenexaminedwellinChinasofar anditappearstobeusefultodeterminethelevelsofproinflammatorycytokinesandTh1 Th2cytokinesintuberculosiscasesinChina Cytokinelevelsintheseraofpatients IL 8 TNF a IL 12 IFN g IL 18 RESULTS 0 0 25 0 50 0 75 0 100 0 125 0 150 0 175 0 200 0 225 0 250 0 275 0 300 0 325 0 350 0 IL 6 IL 8 TNF a IL 12 IFN g IL 18 IL 10 IL 4 IFN gR IL 12R TB CANCER HEALTHY 2区間移動平均 TB 2区間移動平均 CANCER 2区間移動平均 HEALTHY Pro inflammatorycytokinelevelsinsera 0 0 20 0 40 0 60 0 80 0 100 0 120 0 140 0 IL 6 IL 8 TNF a cytokinelevel pg ml TB CANCER HEALTHY 0 0 100 0 200 0 300 0 400 0 500 0 600 0 700 0 IL 12 IFN g IL 18 Cytokinelevel pg ml TB CANCER HEALTHY Th1typecytokinesinthesera IL 12receptorandIFN greceptorlevelsinthesera 0 0 50 0 100 0 150 0 200 0 250 0 300 0 350 0 400 0 450 0 IFN gR IL 12R level pg ml TB CANCER HEALTHY Th2cytokinelevelsinthesera Comparisonofcytokinelevelsbetweendrug resistantand susceptibleTBcases 0 0 100 0 200 0 300 0 400 0 500 0 600 0 700 0 IL 6 IL 8 TNF a IL 12 IFN g IL 18 IL 10 IL 4 IFN gR IL 12R DSTB DRTB ComparisonofcytokinelevelsbetweenSmear positiveand negativeTBcases 0 0 100 0 200 0 300 0 400 0 500 0 600 0 700 0 IL 6 IL 8 TNF a IL 12 IFN g IL 18 IL 10 IL 4 IFN gR IL 12R TB TB Differenceinthecytokinelevelsamongdifferentspecimens 0 0 50 0 100 0 150 0 200 0 250 0 300 0 350 0 400 0 SERUM BALF FLUID CSF Levels pg ml IL 6 IL 8 TNF a IL 12 INF g IL 18 IL 10 IL 4 INF gR IL 12R bronchoalveolarlavagefluid BALF cerebrospinalfluid CSF Sensitivity 30 32