非感染性亚病毒颗粒对乙型肝炎病毒感染的增强效应费.doc

JOURNAL OF VIROLOGY,Feb. 1998, p. 14621468 Vol. 72, No. 2原 文：Enhancement of Hepatitis B Virus Infection by Noninfectious Subviral Particles作 者：MICHAEL BRUNS, STEFAN MISKA, SYLVIE CHASSOT, AND HANS WILL作者单位：Heinrich-Pette-Institut fur Experimentelle Virologie und Immunologie ander Universitat Hamburg, D-20251 Hamburg, Germany发表刊物：JOURNAL OF VIROLOGY,Feb. 1998, p. 14621468 Vol. 72, No. 2 以下为中文翻译稿 ： 非感染性亚病毒颗粒对乙型肝炎病毒感染的增强效应 摘要：乙型肝炎病毒感染过程中，相对病毒粒子数量大量过量的亚病毒颗粒的生物学功能尚不清楚。以鸭乙型肝炎为模型，研究发现亚病毒颗粒能显著增强细胞内的病毒复制和基因表达。该效应对感染滴度、病毒粒子与亚病毒颗粒的比例以及亚病毒颗粒加入的时间具有依赖性。更重要的是，在细胞编码的病毒受体蛋白的结合区域存在时，亚病毒颗粒的pre-S蛋白能触发该增强效应。这些数据表明这种增强作用由pre-S蛋白的反式激活功能或亚病毒颗粒与细胞受体的结合所活化的信号途径所引发。该发现还具有临床意义，它们显示含嗜肝病毒的血清的感染性不仅仅依赖于感染性病毒粒子的数量，还与不含核酸的粒子的数目息息相关。这种由非感染性颗粒引起的感染增强效应在其他一些病毒感染中也是可能的。 嗜肝病毒能够在人类、啮齿目动物和鸟类中引发急性和慢性肝病。其感染通常导致上千倍多于病毒粒子的亚病毒颗粒(subviral particles ，SVPs)的合成。SVPs包含宿主细胞来源的脂质和病毒衣壳蛋白，但不具有病毒核衣壳蛋白和核酸13。乙型肝炎病毒(hepatitis B viruses,HBV)的衣壳蛋白，即小S和大S(或称pre-S)蛋白，在病毒生活周期中具有一系列不同的功能:感染早期，它们与细胞受体结合介导病毒粒子的细胞内摄入；感染晚期，他们对于病毒粒子的组装和分泌十分重要 4，5，34。由于pre-S蛋白不恰当表达导致的病毒粒子组装和分泌的阻断会引起细胞内病毒DNA转录模板拷贝数的上调36。另外，当pre-S蛋白以突变体形式进行表达或者在细胞内堆积时，与病毒致病有一定关系4, 9, 10, 35, 47, 48。最近有报道称，人乙型肝炎病毒的非变异全长pre-S蛋白具有转录激活功能。这可能提示该功能在正常病毒生活周期甚至可能在肝癌发生中起作用18。 鸭乙型肝炎病毒（duck hepatitis B virus， DHBV）pre-S衣壳蛋白P36上可能的受体结合位点和抗原决定簇已了解的很清楚7, 20, 31, 32, 37, 49, 55。但仍不清楚为什么HBVs会产生大批过量的病毒衣壳蛋白并绝大多数最终都形成SVPs。据推测这些SVPs作为体内免疫系统的“decoy”，干扰其对感染性病毒粒子的清除而保证有效感染，因为SVPs与病毒粒子具相同的衣壳蛋白，可与相同的细胞受体结合。令人意外的是这似乎仅发生在使用大批量过量的SVPs的情况下，如高滴度感染28。因此，我们尝试调查在低滴度感染条件下，一种更能反映自然感染的条件，SVPs是否对感染具有不同的影响。令人惊讶的是，我们发现在此条件下SVPs能显著增强感染效应且该效应由pre-S蛋白上一个特殊结构域所介导。1 材料与方法1.1 细胞与病毒 鸭胚原代细胞培养按Kck and Schlicht(30)所述方法进行.简述之:受精鸭蛋在37,湿度50%自动孵化器中孵育21天.然后自鸭胚中取出肝组织,加入0.5%胶原蛋白酶在37消化1小时后分离得到肝细胞。细胞用Williamsmedium E（WME，GIBCO，Eggenstein,Germany）洗涤两次后重悬于其中，在铺有1%Percoll（Sigma）垫的WME中离心。3.5cm微孔板中加入106个细胞后，在37，CO2浓度为5%的条件下培养24小时。此时所用培养基为改良WME，含1.5%二甲基亚枫（Sigma），10-9M胰岛素，2mM谷氨酰胺，10uM氢化可的松，15mM HEPES（pH7.2），以及抗生素（100IU/ml青霉素，100ug/ml链霉素）。 感染时病毒和/或SVPs与细胞在室温下缓慢搅动孵育4小时。没有被吸附的病毒颗粒用WME洗涤细胞三次后被除去。再加改良WME培养7天。培养基收集可作进一步分析，细胞则用磷酸缓冲液（PBS）（pH7.5）洗涤一次后刮下来收集，再用PBS洗涤三次。DHBV感染肝细胞滴度分别为0.01、0.1、1。SVP则来源于经紫外灭活的含不同数目非感染性病毒颗粒的病原血清。紫外灭活是将血清在培养皿中用WME稀释后，在10cm距离内用紫外照射30分钟。该方法已成功用于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus ，LCMV)的灭活46。1.2 病毒和亚病毒颗粒的纯化 病毒颗粒均来自DHBV感染2至3周后的阳性鸭血清。鸭血清首先经低速离心（5000rpm，20min）澄清后，在含20%蔗糖垫的GNTE缓冲液（含0.2M甘氨酸，0.2M NaCl，0.02M Tris以及0.002M EDTA）（pH7.5）中超速离心（200,000g，3h）。沉淀在GETN缓冲液中浸泡过夜后，用超声钻超声打散（10sx3）后将悬浮液过0至40%Urografin(Schering AG, Berlin, Germany)线性梯度（38,000rpm,18h）。DNA点杂交和pre-S免疫印迹显示病毒粒子与SVPs能不完全分离（Fig.1a and b）。为了使两种颗粒能更有效的分离，可将含有或不含病毒DNA的病毒颗粒分部收集，然后与26.5%Urografin混匀后超速离心（38,000rpm，18h）。此时,DHBV DNA点杂交和pre-S免疫印迹分析显示，含有或不含可检测病毒DNA的病毒颗粒已被更好的分离(Fig.1c to f)。部分3和4中的病毒粒子（Fig.1c和d）和部分14和15中的SVPs（Fig1.e和f）被用于感染实验。为了除去Urografin，可将溶液用GNET缓冲液稀释5倍后，200,000g超速离心而被沉淀纯化，-70保存备用。所有超离步骤均是在4下用SW50转子(Beckman, Munich, Germany)完成的。1.3 SVP和完全病毒粒子数目测定由于病原血清中常认为含有极少的缺损基因组，通过点杂交所测定的病毒基因组分子数目即被认为与病毒粒子的数目相当21,51。而SVPs的数目则是通过pre-S蛋白特异性免疫印迹来确定（以上述Urografin离心纯化后确定数目的病毒粒子为标准）。在此分析中，具相同信号强度的病毒粒子和SVP样品则被认为含有相同数目的颗粒，因为两种类型的病毒颗粒大小相近，pre-S 与 S 蛋白比例也相当。据此分析，被用于感染实验的病原血清中所含的SVP约为病毒粒子的1000倍，这与以前发布的DHBV血清数据相吻合。1.4 DHBV DNA的分离和分析感染细胞中DHBV复制中间体按以下方法进行纯化12：细胞用50mM Tris-Hcl (PH8.0)-1Mm EDTA-1% Nonidet P-40进行裂解，10,000g离心1min，取上清.上清液中加入蛋白酶 K（500ug /ml）(Sigma)37消化过夜，病毒DNA即被抽提出来。DNA用1%琼脂糖胶进行分离后，转至Hybond N膜（Amersham），进行紫外交联、Southern blot 和点杂交。DHBV-26 DNA的EcoRI酶切片段经胶纯化后用a-32PdCTP(Megaprime; Amersham)标记作为杂交探针，而含DHBV-26的质粒DNA经定量后将用于DHBV DNA的定量分析。FIG. 1. 通过两次Urografin 梯度超速离心分离含DHBV DNA的粒子和SVPs。(a)一次 Urografin 梯度(0 to 40%)超速离心（38,000 rpm X18 h ）后分部收集DHBV病毒粒子和SBV。用DHBV DNA点杂交（上）和pre-S免疫印迹（下）进行检测。病毒DNA和pre-S蛋白的分布显示：含病毒DNA的粒子主要分布于fractions 5 to 7，而SVP则主要集中于fractions 8 and 9。(c)将第一次超速离心的fractions 5 to 7与26.5% Urografin混匀后进行第二次超速离心，进行分部收集后，对其进行DHBV DNA点杂交（上）和pre-S免疫印迹分析。结果显示含病毒DNA的粒子主要分布在fractions 3 and 4；含Pre-S蛋白的粒子则分布于fractions 1 to 12。 (e) 将第一次超速离心后含SVP的fractions 8 和 9与26.5% Urografin混匀后进行第二次超速离心，进行分部收集后，对其进行DHBV DNA点杂交（上）和pre-S免疫印迹分析。同时将所收集的各个部分的50%进行SDS-PAGE分析，银染观察发现蛋白只出现在fractions 13 to 16。这些蛋白主要是小S和pre-S。另在70 kDa有一带能与热休克蛋白70 （heat shock protein 70，HSC70)抗体发生反应（未发表）。这与HBV 和 DHBV 最近研究报告(38)相一致，提示HSC70是DHBV SVP的一个主要组分。(b, d, and f)3个梯度所收集各部分DHBV DNA和总蛋白定量测定。 LI, 免疫印迹阳性对照（被感染鸭子的肝组织蛋白提取物）。1.5 DHBV pre-S蛋白的检测为检测细胞内pre-S蛋白，将2.5X105个细胞在20ul SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis)上样缓冲液（4%SDS，10%-巯基乙醇，0.05M Tris-HCLPH 7.0）中裂解，煮沸3分钟后，用SDS-5至20%丙烯酰胺梯度胶进行分离33。该PAGE可用银染40或免疫印迹进行分析。对于免疫印迹，先将蛋白转至硝酸纤维素膜(Schleicher & Schll, Darmstadt, Germany)，膜在依次与抗重组pre-S蛋白的免抗12、过氧化物酶标记的抗免的免疫球蛋白G(Medac, Hamburg, Germany)孵育。吸附抗体通过被强化的化学发光进行观察（Amersham相应试剂盒）。1.6 DHBV pre-S缺失突变体的构建和转染实验 DHBV pre-S 缺失突变体由DHBV-26基因组的寡核苷酸定向诱变所产生45，再以EcoRI片段同方向地连接到载体pMa5-8 and pMc5-8的多聚接头上。DNA缺失经由质粒DNA测序确证。为获得病毒颗粒，10g EcoRI 线性化质粒以磷酸盐沉淀法（calcium phosphate precipitation）转染LMH细胞11, 15。在转染4天后收集细胞培养物，不需任何纯化步骤可直接用于感染实验。2.结果2.1 SVP在低滴度条件下增强DHBV感染效应用不同稀释度鸭血清（含0.01，0.1或1 virions/cell）感染原代鸭肝细胞。而经紫外灭活的含不同数目非感染性病毒颗粒的病毒血清稀释液则作为SVP的来源，与感染性血清稀释液共孵育。经紫外灭活含103和104SVPs（每个细胞）的DHBV阳性血清或DHBV阴性血清将作为对照，感染细胞。由免疫印迹检测的细胞内pre-S蛋白量作为增殖性感染的检测指标。结果发现，在含有0.01，0.1和1 virion/cell血清感染的细胞内，均可检测到全长pre-S蛋白P36及其降解产物P28（12）（Fig.2a，lanes 1 to 9）；而对照细胞内则检测不到任何pre-S蛋白（Fig.2a，lanes 10）。当低剂量DHBV（0.01和0.1 virion/cell）感染细胞时，加入一定数量SVPs（103 or 104 SVPs/cell）一起感染，可在细胞内检测到更高水平的pre-S蛋白（Fig.2a，lanes2和3 and lanes5和6)。但高剂量DHBV(1 virion/cell)与SVPs一起感染时，pre-S蛋白的水平则不发生变化(Fig.2a，lanes 7 to 9)。由此可见，当SVP相对病毒粒子适当过量且在低滴度条件下进行感染时，SVP能增强病毒感染或细胞内pre-S蛋白的合成。2.2 SVPs引起的感染增强效应具剂量依赖性仅用不同剂量SVPs与细胞孵育时，检测不到任何pre-S蛋白（Fig2b, lanes5 to 7）；0.01 DHBV 病毒粒子/细胞 和10SVPs/cell感染细胞时，只检测到少量pre-S蛋白(Fig2b,lane 4)；SVP剂量达105/cell时，pre-S蛋白的水平显著增强，尤其在104SVP/cell浓度剂量时，效果最明显（Fig2b,1anes 2 and 3）。但当SVP浓度达106/cell时，cell内也检测不到任何pre-S蛋白(Fig. 2b, lane 1)。因此，滴度为0.01条件下，只有当SVP浓度不高于105 SVP/cell时，表现出对感染的增强作用；当SVP浓度达106/cell时，将呈现出强烈的抑制作用，该抑制作用可能是由于SVP饱和了细胞表面所有的特异性或非特异性的病毒粒子和SVP结合位点。2.3 SVPs引起的感染增强效应具有时间依赖性此时，我们要问SVP是在感染之前，期间还是期后发挥作用？非特异性血清蛋白是否在感染增强效应中起作用？在本实验中，作为复制尺度的细胞内DHBV DNA 复制中间体数目将通过Southern blot进行分析（用32P标记的DHBV DNA探针与cell总DNA杂交）。纯化的SVPs（102/cell）在病毒（0.1virion/cell）感染之前，同时或之后与肝细胞孵育。当1000倍过量的SVP在感染之前24小时（h）加入，病毒粒子单独感染时所能产生的少量病毒DNA也检测不到(Fig. 3, lanes 2 and 4)。FIG. 2. 剂量依赖的SVP对DHBV感染的增强或抑制作用. (a)免疫印迹检测与鸭血清孵育过的细胞提取物中pre-S蛋白(P36 and P28)：lane 10：不含DHBV病毒粒子；lanes 1 to 9：不同数目的活性病毒粒子（含SVP）(lanes 1 to 9)和不同数目的由紫外灭活病毒粒子产生的SVP(lanes 2, 3, 5, 6, 8, and 9)。SVP对感染的增强效应仅在低滴度感染时表现出来。病毒粒子GANRAN(b)DHBV阳性（lanes 1 to 4）或阴性（lanes 5 to 8）血清感染的细胞提取物中pre-S蛋白免疫印迹，感染时加入了不同剂量的部分纯化的紫外灭活SVP。当106 SVPs/cell 浓度的SVP加入时，SVP表现出对感染的抑制作用。而加入105 SVPs/cell 或104 SVPs/cell 浓度的SVP时，对感染的增强逐渐加强。单独加入SVP时，则在细胞内检测不到任何的preS蛋白(lanes 5 to 8)。FIG. 3. SVPs引起的感染增强效应具时间依赖性。复制中间体的Southern blot 分析显示高度纯化的SVP只有与病毒粒子一起孵育或在感染后加入时具强增强效应。lanes 1 and 8：空白对照；lanes 2: 0.1 DHBV virion/cell ；lanes 3: 0.1 DHBV virion/cell +102 SVPs/cell ；lanes 4 to 7:SVP在感染前加入；lanes 9 and 10：SVP与病毒粒子一起孵育；lanes 11 to 14：SVP在感染后加入。RC:松散型环状 DHBV DNA；SS:单链DHBV DNA。而相同数量的SVP在感染前不久（-4h）、同时（0h）或之后（+4h和+24h）加入时，都可看到复制中间体浓度的增加(Fig. 3,lanes 6, 9, 11, and 13)。同步进行的细胞内pre-S蛋白水平检测也显示类似的动力学曲线（未发表数据）。因此，在病毒感染前较早的加入SVP并不能增加病毒产生；在感染前不久加入增强效应也比感染时加入弱；SVP在病毒进入后一段不长的时间内加入则会使增强效应达到最强；SVP在感染后48h和72h时加入与其在感染后24h或感染时加入具有相似的效果。48h后增强效应的减弱显示感染后SVP的增强效应具时间限制性。另外，感染前4h或24h加入SVP不具显著增强效应提示SVP的感染增强效应不是由细胞病毒受体或受体偶联蛋白的长期上调或信号通路的长期活化所引起，同时也说明非特异性血清蛋白不介导该增强效应。2.4 pre-S蛋白上一个特殊区域对SVP介导的感染增强作用至关重要。SVP与细胞的病毒受体结合和SVP的细胞摄入也许是其增强感染的先决条件。为此，我们利用经紫外灭活的含不同pre-S突变体的病毒粒子进行感染以确认SVP pre-S蛋白上可能的受体结合位点20,31,32,37,49是否与感染增强效应相关。这些含不同pre-S突变体的病毒粒子是用在pre-S含不同区域缺失突变的DHBV基因组（Fig. 4a）经EcoRI线性化后转染鸡肝细胞系（chicken hepatoma cell line，LMH）23所得。同时，分别自鸭（WT3T）和鹅（WT1T）中分离得到的非感染性病毒基因组DHBV-344、 DHBV-145将作为感染对照。感染用病毒粒子（0.01/ cell）由自然感染的鸭子中分离。Pre-S蛋白表达水平分析(Fig. 4b)显示：除D1053和D1119外，所有紫外灭活的pre-S缺失突变体和对照DHBV 基因组的病毒颗粒都能显著地增强DHBV的感染，该结果也与部分突变体的复制中间体数目分析结果(Fig. 4c)一致。在不增强感染的D1053和D1119突变体中，pre-S蛋白85-96或107-125位氨基酸被缺失了(Fig.4)。有意思的是，这两个区域还是推认细胞受体P120和P170/GP180蛋白结合区域的一部分20,31,32,37,49 (Fig. 4a)。同时，在这些突变体的pre-S蛋白中大多已知的抗体中和位点7,37,55都已被删除。综上所述，SVP的辅助效应依赖于pre-S蛋白上的一个特殊区域，该区域可能与细胞的病毒受体结合，也可能是中和抗体的靶目标。3. 讨论本文调查研究了非感染性SVP能否影响嗜肝病毒的感染。过去，人们推测SVP能作为decoy吸附中和抗体，也有实验表明SVP能竞争性结合病毒受体28,40。本研究的数据则表明,在体外DHBV SVP既能刺激也能抑制DHBV的感染，这依赖于病毒滴度和SVP与病毒粒子的比例。SVP介导的感染增强效应需要pre-S蛋白的参与，且当pre-S蛋白上的一个特殊区域被缺失后，这种效应也随之消失。另外，只有当SVP在感染开始或感染后不久即加入的情况下，才能观察到这种增强效应。总言之，SVP在特定条件下，能通过瞬间的，pre-S蛋白依赖的信号传导或反式激活机制增强感染.该增强机制在SVP与细胞受体结合或SVP被摄入后迅速的被激活。当使用相对病毒粒子数目超过量的SVP（106SVPs+0.01virion/cell Fig. 2b）时，SPV对DHBV的感染具抑制作用，这与以前的报道28,41即SPV和病毒粒子能特异性地结合敏感肝细胞且竞争相同的肝细胞受体分子相吻合。如果每个肝细胞有104个病毒受体的估计是正确的28，当SVP与受体和病毒粒子与受体的比例分别为100和10-6时，对感染的有效抑制是可以达到的(Fig.2b)。有意思的是，当105SVP/cell浓度的SVP用于相同实验时，感染是被增强的(Fig.2b)，尽管此时大多数的受体仍被SVP所阻断。该现象可以通过假设每个我们所用肝细胞中有大约106个病毒受体来解释。这样，就不存在对病毒受体分子的竞争，所有SVP和病毒粒子均可找到未被阻断的受体。因为我们建立的肝细胞原代培养来源于胚肝，其上有较多病毒受体也是可能的，另外，pre-S蛋白的非特异性结合以及实验条件的差异均可能导致结果的多样性。 FIG. 4.自然分离的DHBV分离株和pre-S突变体的病毒粒子经紫外灭活后对DHBV感染的影响。 (a) 转染鸡肝细胞系的野生型WT3T DHBV、WT1TV DHBV以及pre-S缺失突变的DHBV-26基因组示意图。括号内为缺失氨基酸的位置。(b and c) 转染鸡肝细胞系（chicken hepatoma cell line，LMH）3天后收集病毒粒子，经蔗糖垫浓缩(0.1 virion and 100 SVPs/cell)和紫外灭活后用于感染。感染方法参照Fig. 2。（b）:转染肝细胞内pre-S 蛋白的免疫印迹进行检测；（c）:复制中间体的Southern blotting 分析. RC:松散型环状 DHBV DNA；SS:单链DHBV DNA。我们还尝试排除血清组分参与SVP介导的感染增强效应的可能性。一种用于分离纯化感染性RNA病毒的两步超离心方法3，46被用于分离DHBV 病毒粒子和SVP，使得粒子的分离有了很大改进。由此纯化的SVP检测不到任何病毒DNA（点杂交后进行长时间曝光仍没有信号未发表），也不具感染性。相对应纯化的病毒粒子也仅含极少几乎不含任何SVP（Fig.1c and d with Fig.1e and f）。由这些高度纯化的SVP和病毒粒子所导致的感染增强效应充分说明单独的血清组分不介导也不参与SVP介导的感染增强效应，但我们仍不能排除血清蛋白通过吸附于SVP表面发挥作用。pre-S蛋白是SVP的一个组分已被充分证实。病毒颗粒中pre-S蛋白特定区域的缺失（85 to 90位和107 to 125位氨基酸）会导致SVP增强感染效应的消失。这些序列与已知中和抗原决定簇7, 37,55、可能的受体蛋白结合位点20, 31,32, 37, 49以及宿主域决定序列19的重叠都显示SVP通过这些pre-S蛋白序列与真正的病毒受体结合。另外pre-S蛋白潜在的蛋白切割位点17、磷酸化位点16以及上下游序列都可能在SVP介导的感染增强效应中起作用。不论pre-S蛋白在感染中起什么作用，它介导的SVP与细胞受体的结合似乎是增强感染的先决条件。SVP在感染后加入时能最显著地增强感染也充分论证了这一推测。由于嗜肝病毒颗粒特殊的细胞进入机制（非pH依赖但ATP依赖的细胞内吞作用29），pre-S蛋白通过与细胞内哪一组分发生作用而发挥其增效作用仍不清楚。但感染前较早的加入SVP不能导致感染的增强，说明SVP所引发的信号转导具瞬时性。我们认为DHBV病毒颗粒与受体的结合可引发信号传导，而不依赖于病毒基因的表达和复制。这在很多病毒中均有报道。EB病毒（Epostein-Barr virus，EBV）与受体的结合能调节蛋白激酶C和酪氨酸激酶的异构42，并导致细胞内蛋白pp105的磷酸化2。人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)衣壳蛋白能活化酪氨酸激酶和蛋白激酶C,后者磷酸化一个92.5kDa的可能细胞膜蛋白受体24。小鼠乳腺肿瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)衣壳蛋白gp52与其受体的结合能刺激许多细胞生物活性，包括氨基酸积聚1。人类获得性免疫缺陷病毒型（human immunodeficiency virus type 1 ，HIV-1）的可溶性糖蛋白sgp41能促进主要组织相容性复合物类(major histocompatibility complex class, MHC)和细胞间黏附分子-1（Intercellular adhesion molecular type 1,ICAM-1）在某些细胞中的表达8。另外，复制缺陷的呼肠孤病毒引发的受体的结合与聚积足以引起信号传导抑制细胞DNA的合成14。单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)则在没有病毒蛋白合成的条件下，诱导细胞基因的表达26。综前所述，对于很多病毒，由衣壳蛋白与病毒受体相互作用所引发的生物信息传递理论都已建立。因此，对于DHBV SVP的pre-S蛋白与病毒受体结合能诱发细胞内信号传递事件的假说也是可行的，这可能预示DHBV受体自身具有信号传递的功能或者它与信号传递组分相关联。目前，我们还仅仅能推测SVP介导的感染增强效应采用哪种机制。当SVP进入细胞，全长或截短的pre-S蛋白即被释放到细胞质和/或细胞核，直接或间接的反式激活病毒的转录。这一点从细胞内产生的DHBV pre-S蛋白43、HBV pre-S1蛋白27以及截短的HBV pre-S/S蛋白6, 25的反式激活活性得到印证。最近有报道称HBV pre-S1蛋白在内质网两侧所引发的压力能活化细胞内转录因子52，进而增强感染。另外，pre-S与细胞受体结合引起的其他细胞信号传导事件，如蛋白酶、激酶、磷酸酶的活化，小分子浓度的改变等也是可信的，并与SVP所介导信号的瞬时效应相吻合。如果这些是事实，则病毒感染的极早期步骤包括病毒基因组去壳、向核运输、共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的形成都可能已被加强。这样的话，核心颗粒磷酸化的加强能促进基因组从核心的释放和向核运输。来自磷酸化和去磷酸化能调节基因组去壳和向核运输22,53,54的间接证据使该假说更具吸引力。由于病毒DNA cccDNA形式的拷贝数与病毒生产效率密切相关，它也就随之上调。有意思的是，由一些DHBV突变体表达的截短pre-S蛋白也可促进cccDNA的形成，因为pre-S蛋白似乎具有控制cccDNA拷贝数目所需的类基质蛋白的功能48。该作者在其后的研究中和我们持相同观点，认为DHBV pre-S蛋白还具其他活性能上调cccDNA拷贝数36。倘若HBV和DHBV的SVP对感染具有类似的效应，则可以预知慢性HBV携带者血清中SVP的水平将共同决定感染程度。另外，在HBV的传播过程中，感染效应的加强更为重要，因为大多慢性HBV携带者的血清中仅含有极低数量的病毒粒子，其中还包括很大一部分缺损病毒，却有上十亿倍的SVP.而在DHBV血清中则含有高浓度的病毒粒子（极少缺损病毒）和仅1000倍过量的SVP21。哺乳动物嗜肝病毒的感染实验包括HBV，跟其他病毒一样，需要去阐明在其他病毒系统中DHBV SVPs能在多大程度上增强感染。参考文献：1. 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