光 合 关 键 酶 的 测 定 方 法.doc

光 合 关 键 酶 的 测 定 方 法一、酶液的制备 取植物样品0.5g左右放入用液氮预冷的研钵中，迅速研磨成粉末状，加入3.0ml（w/v为1：6）预冷的100 mM Tris-H2SO4提取缓冲液【PH 8.2，内含7.0 mM 巯基乙醇，1.0 mM EDTA-Na（乙二胺四乙酸钠盐），5% 甘油和1% 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）】，混匀后在4下反应20min，混合液于4下15000 r/min离心15min，取上清液备用。二、RUBPC活性的测定方法（参照Racker方法并略加改动）反应混合液（总体积3.2 ml）组成：0.1 M Tris-HCl缓冲液 (pH 8.0)、0.1 M MgCl2、50 mM腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、50 mM二硫苏糖醇（DTT）、2.0 mM NADH、1.0 mM EDTA-Na各0.3 ml，200 M NaHCO3 0.1ml，蒸馏水1.0ml，3-磷酸甘油酸激酶（PGK）/3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAP-DH）（15u/15u） 0.1ml，酶提取液0.1ml ，30恒温水浴预温10 min，将反应体系摇匀倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，于340nm下测吸光度值E0，最后加入9.0 mM 1，5-二磷酸核酮糖（RuBP） 0.1ml启动反应，立刻每隔1015s间隔测定光吸收的变化。三、PEPC活性的测定方法（施教耐等方法）反应液总体积3.1 ml，内含1.0 ml 0.1 M Tris-H2SO4 (pH 9.2)，1.0 ml酶提取缓冲液，0.1ml 10 mM MgCl2，0.1ml 10 mM NaHCO3，0.2 ml 40 mM磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），0.3ml 1.0 mg/ml NADH，过量的苹果酸脱氢酶（MDH，约10.5U）0.2 ml，于28水浴预温10min，用0.2 ml PEPC提取液启动反应，迅速在340nm下测吸光度的下降。RuBPCase reaction medium1. 0.1M Tris-HCl (pH 8.0)2. 0.1M MgCl23. 50mM ATP4. 50mM DTT 各0.3 ml5. 2mM NADH6. 1mM EDTA7. 200M NaHCO3 0.1ml8. PGK/GAP-DH （15U/15U） 0.1ml9. 9 mM RuBP 0.1 ml10. 酶提取液 0.1 ml11. 蒸馏水 1.0 ml 总体积 3.2 mlPEPCase reaction medium1. 0.1M Tris-H2SO4 (pH 9.2) 1.0 ml2. 酶提取缓冲液 1.0 ml3. 10mM MgCl2 0.1ml4. 10mM NaHCO3 0.1ml5. 40mM PEP 0.2 ml6. 1mg/ml NADH 0.3 ml7. 过量的MDH（约10.5U）0.2 ml8. 酶提取液 0.2 ml 总体积 3.1 ml酶活性测定反应液组成：注：参考文献董永华等，ABA和6-BA对水分胁迫下玉米幼苗碳素同化关键酶的影响。植物营养与肥料学报，1997，3（2）：182187.四、RUBPC和PEPC活性测定操作步骤 操作流程如下：准确称取0.5g植物样品，剪碎放入预冷研钵中加入液氮，迅速研磨加入3.0 ml提取缓冲液，4下反应20min溶液在4下15000r/min离心15分钟PEPC测定RUBPC测定上清液即为粗酶液，冰箱内保存备用（4）RUBPC反应液 2.9 mlPGK/GAP-DH 0.1ml(15U/15U)酶提取液 0.1ml蛋白测定PEPC反应液 2.5 ml PEP 0.2 ml MDH（约10.5U）0.2 ml取0.1ml粗酶液加5.0ml考马斯亮兰染色剂，混匀放置2.0 min，于595nm比色30水浴10min340nm测光密度E028水浴10min加酶提取液0.2 ml启动反应，迅速在340nm测吸光度的下降（3min）加RUBP 0.1ml启动反应，迅速检测吸光度的减少（1min）说 明：1. RUBPC反应液（2.9 ml）包括：0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)、0.1 M MgCl2、50 mM ATP、50 mM DTT、2.0 mM NADH、1.0 mM EDTA-Na各0.3 ml，200 M NaHCO3 0.1ml，蒸馏水1.0ml。2. PEPC反应液（2.5 ml）包括：1.0 ml 0.1 M Tris-H2SO4 (pH 9.2)，1.0 ml酶提取缓冲液，0.1ml 10 mM MgCl2，0.1ml 10 mM NaHCO3，0.3ml 1.0 mg/ml NADH。3. 上述两种反应液的配制方法是：先按要求的浓度配制各组分试剂溶液，然后根据各试剂的体积按比例混合而成。4. 为减小实验误差，粗酶液提取出来后，应先测RUBPC活性，其次测PEPC活性，最后测定可溶性蛋白含量。可溶性蛋白的测定反应液配制：0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇(用无水乙醇加水兑成)中，加入100毫升85%磷酸，定容至1000毫升，过滤。(配制时要避光)(1000ml反应液可做330个样品)测定：20l酶液+3ml G-250放置2分钟，595纳米比色，同时做空白（20微升缓冲液+3毫升G-250）。结果计算：可溶性蛋白（mg/Gfw）=(CV/Va)/WC为查标准曲线值，V为提取液总体积(m