模板聚合和分子印迹技术bbbb.ppt

第六章模板聚合和分子印迹技术 在自然界的生命代谢 繁衍和生物进化过程中 各色各样的分子模板过程往往起着极其重要的作用 模板聚合 DNA在复制时 首先是组成双螺旋的二条链先拆分成两条单链 以DNA单链为模板 按照碱基互补原则合成出一条互补的新链 这样新形成的两个子代DNA分子就与原来DNA分子的碱基顺序完全一样 在酶催化的反应中 第一步是酶与底物形成酶 底物中间复合物 当底物分子在酶作用下发生化学变化后 中间复合物再分解成产物和酶 人类在认识宏观世界的过程中 发明了以 模板 原理为基础复制物件的各种制造工艺 如铸造等 在分子水平上采用 模板原理 进行化学反应 特别是生物化学反应则是近30年来的事情 1986年德国人G Wulff首次提出模板聚合物的合成原理及其在分离 催化和生物医学领域的应用前景 时至今天 模板聚合和模板合成已经成为高分子化学和生物合成领域最受瞩目的研究领域 指单体在具有特定结构的聚合物存在下进行的聚合反应 这些特定结构的聚合物对单体的聚合起着模板作用 例如 它们能加速聚合反应 新生成的聚合物的结构和性能等方面都能受模板的影响 甚至生成物可以成为模板的模制品或复制品 在聚合体系中能控制聚合反应的高分子链称为高分子模板 用高分子模板与单体聚合称为铸型反应或模板聚合 利用模板聚合可以控制聚合物分子的结构 如甲基丙烯酸甲酯在二甲基甲酰胺 DMF 溶液中的光聚合 若加入有规立构聚甲基丙烯酸甲酯作为高分子模板 单体链增长反应就在模板上继续进行 大大地加速了聚合反应速率 获得与模板结构相同的聚合物 模板聚合 templatepolymerization 模板聚合反应可用以下三步表示 模板 T 与单体 M 形成复合物 模板聚合 模板与 复制 高分子的分离 可见模板作用是一个高分子对合成另一个高分子所起的模具或样板作用 在聚合过程中 模板指导新高分子的合成 并决定产物的组成 结构 构象和分子量 因此 模板聚合能获得具有指定聚合度或所需立体构型 规定序列结构的聚合物 是高分子设计 合成及仿生高分子方面的重要手段 模板聚合的原理是基于模板高分子的组成单元与单体小分子之间的相互作用 如氢键 离子吸引 电子给体和受体的相互作用或形成共价键等 这种作用为单体的聚合创造有利的条件 提供可以仿效的样板 模板聚合的原理 实现模板聚合的方式主要有以下几类 1 利用酸碱基团之间的相互作用 通过含有酸性基团 或碱性基团 的高分子与含有碱性基团 或酸性基团 的单体之间的相互作用 可以实现模板聚合 例如以聚苯乙烯磺酸PSSA为模板使4 乙烯吡啶VP进行聚合 PSSA在水溶液中高度解离 呈伸展状态 被水合氢离子包围 一旦4 乙烯吡啶进入溶液之中 就中和酸离子 沿高分子链呈化学计量的吸附 吡啶基团被季铵化 形成吡啶基朝着高分子模板和乙烯基向着外侧的有规则的排列 2 利用电子给受体 A D 电荷转移的作用 高分子电子给体 或受体 与单体电子受体 或给体 之间通过电荷转移可以实现模板聚合 例如 马来酸酐为强电子受体 在一般条件下不发生自聚 但在聚4 乙烯吡啶等给电子体存在下 由于两者之间有着A D电荷转移相互作用 就可以进行自聚得到马来酸酐聚合物 但在4 乙烯吡啶和苯乙烯共聚物存在下 只能得到含马来酸酐很少的黑色树脂 由此证明聚4 乙烯吡啶的模板作用 所得的聚马来酸酐反转来又可作为给电子单体4 乙烯吡啶聚合的模板 由于模板的存在 反应速率加快 产物聚4 乙烯吡啶的聚合度与所用的模板聚马来酸酐的聚合度是相对应的 3 通过氢健的作用在多肽合成中 N 羟基 氨基酸内酐NCA在聚肌氨酰二乙胺存在下进行开环聚合 由于NCA分子通过形成氢键被吸附在聚肌氨酸链上 因此聚合速率增大 可认为是一种模板效应 在生物遗传过程中 核酸是一种遗传物质 通过核酸碱基之间的氢键作用 以脱氧核糖核酸DNA为模板产生核糖核酸RNA 从模板上转录信息 从而达到把亲代的某些特征传给子代的目的 4 与单体的共价键结合的模板聚合用经特殊方法合成的具有一定分子量的甲酚甲醛低聚物作模板 使它们的酚基与丙烯酰氯单体反应生成丙烯酸酯 在苯中极度稀释后 用偶氮二异丁腈引发聚合 然后水解 得到了具有相应分子量的聚丙烯酸产物 它虽然属于低聚物的范畴 但从得到的原定分子量的 复制物 来说 确实为模板聚合 模板聚合物 又称为 印记化合物 是内部具有特定形态和大小的孔穴 以及确定空间位置排列的官能团的交联聚合物 分子印迹技术 分子印迹聚合物 分子印迹聚合物的特性 分子印迹方法的分类 分子印迹原理 识别和表征 分子印迹技术的应用 分子印迹技术的应用前景 分子印迹技术 分子印迹技术 MolecularImprintingTechnique MIT 又称分子烙印技术 是近年来集高分子合成 分子设计 分子识别 仿生生物工程等众多学科优势发展起来的一门新型的交叉学科 分子印迹技术是指为获得在空间结构和结合位点上与某一分子 印迹分子 完全匹配的聚合物的实验制备技术 分子印迹技术的出现是受免疫学启示的结果 Pauling提出的抗原抗体理论认为 当外来抗原进入生物体内时 体内蛋白质或多肽链会以抗原为模版 通过分子自组装和折叠形成抗体 这预示着生物体所释放的物质与外来抗原之间有相应的作用基团或结合位点 而且它们在空间位置上是相互匹配的 这就是分子印迹技术的理论基础 分子烙印技术发展简介 1894年 Fischer s提出 锁匙理论 1940年 Panling的 抗体合成 1949年Dickey所设想的 特种吸附剂 近代MI理论是上世纪80年代 由Wulff和Mosbach确立1993年Mosbach等在Nature上发表分子印记的 塑料抗体 和仿生免疫分析 分子印迹技术自20世纪70年代以来发展十分迅猛 特别是1993年Vlatakis在 Nature 上发表有关茶碱分子的印迹聚合物 MolecularImprintedPolymers MIPs 的报道后 每年公开发表的相关论文数几乎直线上升 目前主要从事MIT研究工作的国家有瑞典 日本 德国 美国 英国 中国等十多个 国内主要研究单位有大连化物所 南开大学 兰州化物所 上海大学 军事科学院毒物所 湖南大学 东南大学 防化研究院等 茶碱又名二氧二甲基嘌呤具有强心 扩张冠状动脉 松弛支气管平滑肌和兴奋中枢神经系统等作用 主要用于治疗支气管哮喘 肺气肿 支气管炎 心脏性呼吸困难等疾病 MIT之所以发展如此迅速 主要是因为它有三大特点 预定性 predetermination 识别性 recognition 实用性 practicability 预定性 根据不同的目的制备不同的MIPs 以满足不同的需要 识别性 MIPs是按照模版分子定做的 可以专一地识别印迹分子 实用性 它可以与天然的生物分子识别系统相比拟 例如 酶和底物 抗原与抗体等 由于它是化学合成方法制备的 具有天然分子系统不具备的抗恶略环境的能力 从而表现出高度的稳定性和长的使用寿命 分子印迹聚合物 分子印迹聚合物是一类内部具有固定大小和形状的孔穴并具有确定排列功能基团的交联高聚物 分子烙印的基本原理 实现分子烙印要经过的3个步骤分子烙印的分类分子烙印聚合物 MolecularImprintedPolymer MIP 的制备方法 实现分子烙印要经过的3个步骤 功能单体和烙印分子在一定条件下形成某种可逆的复合物加入交联剂将这种复合物 冻结 起来 制得高聚物将烙印分子抽提出来 这样在聚合物的骨架上便留下了一个对烙印分子有 预定 predetermined 选择性的分子识别位 分子烙印的分类 共价型 烙印分子和单体通过可逆的共价作用 如形成可逆的硼酸酯和席夫碱 形成复合物非共价型 烙印分子和单体则通过氢键 偶极 离子 金属螯合 电荷转移 疏水乃至范德华力相互作用形成复合物 非共价型的分子烙印是一种分子自组装的过程 共价型烙印聚合物孔隙 非共价型烙印聚合物孔隙 模板分子 印迹分子 即待分离 待识别物质的纯品 一般来说分子中含有强极性基团的化合物可以制备高效能的MIPs 目前用于分子印迹的分子很广泛 如药物分子 氨基酸 碳水化合物等均已成功地用于分子印迹聚合物的制备中 模板分子的用量 合成 时 模板分子 单体和交联剂的相对用量对 性能有直接的影响 模板分子的最佳量通常为总量的5 当用三乙烯基化合物作为交联剂时 模板分子的比例可增大 此外 模板分子的用量还受到其溶解性和获取难易程度的影响 功能单体 必须带有能与印迹分子发生作用的功能基 如与印迹分子成共价键的基团 产生氢键的基团或能与印迹分子发生离子交换作用的基团等 比较常用的功能单体有丙烯酸 丙烯酰胺和苯乙烯类 对某些金属螯合反应还常常用到亚氨基二乙酸衍生物 另外 天然聚合物如蛋白质也可作为单体对其他分子进行印迹 共价型分子烙印中常用的功能单体有含乙烯基的硼酸和二醇以及含有硼酸酯的硅烷混合物等 非共价型分子烙印中常用单体是甲基丙烯酸 MAA 等 交联剂 它的作用是使模板分子和功能单体形成高度交联 刚性的聚合物 固化 单体的功能基团在模板分子周围的特定位置 并保持对印迹分子起识别作用的位点在使用过程中空间形状不发生变化 使特异选择性得以保留 为了得到高度交联的聚合物 目前最有效的交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯 三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯 季戊四醇三丙烯酸酯等 单体和交联剂对烙印聚合的影响 在聚合时增加交联剂的用量有利于形成稳定和完整的 印记 位点 一般而言 对于易挥发的有机待测物需要制备高度交联的聚合物 对于具有一定形状的模板分子 交联剂的用量适量降低 单体 模板复合物的刚性大 形成的位点与模板分子的吻合程度高 在位点上发生相互识别和键合作用时熵的变化小 有利于提高亲和力和选择性 溶剂 在分子印迹中发挥着重要作用 聚合时 溶剂可能影响模板分子和功能单体间的作用强度或聚合反应的动力学 一般来说 溶剂的极性越大产生的识别效果越弱 应用极性强的溶剂会不可避免地减弱模板分子和功能单体间的相互作用 从而导致弱的识别 另外 溶剂还会影响聚合物形态学 使聚合物溶胀导致结合部位三维结构的变化 引起弱的结合 通常识别用溶剂最好与聚合用溶剂一致 避免任何溶胀问题 制备步骤 MIPs制备过程中的聚合反应是通过自由基引发的 一般以偶氮二异丁腈或偶氮二异庚腈为引发剂 常用的引发方式有光照 加热 加压 电合成等 低温光引发应用最为普遍 其中又以紫外光的能量适中而应用最多 聚合的方法有沉淀聚合 原位聚合 乳液聚合 多步溶胀聚合和表面印迹法等 应依据其所用场合选择合适的方法 第一步 使目标分子 印迹分子或模板分子 和具有适当功能基团 可以形成聚合物的功能单体分子在适当的介质条件下形成单体 模板分子复合物 第二步 在单体 模板分子复合物体系中加入过量的交联剂 在致孔剂的存在下 使功能单体与交联剂发生聚合反应形成高分子聚合物 于是 功能单体上的功能基团就会在特定的空间取向上被固定下来 第三步 透过适当的物理或化学的方法将模板分子从上述高分子聚合物中提取出来 得到分子印迹聚合物 分子印迹聚合物的特点 在分子印迹技术中所用的聚合物必须具有特定的物理及化学性质 并对一些物理化学作用具有一定抵抗能力 除具有上表所列的特点外 印迹聚合物还具有制备简单快速 稳定性强 可以长期保存等优点 尤其是对某些生物物质检测与分离 若无天然物质可以对应其特异性相互作用 也可通过分子设计制备出具有人工识别位点的印迹聚合物 用于对该物质的分析或纯化等 分子印迹方法的分类 返回 预组装法 preorganization 也称共价型分子印迹法 是印迹分子首先共价联结到单体上 然后聚合 聚合后再打开共价键去除印迹分子的方法 优点是在聚合过程中 功能基团能得到比较精确的空间构型 缺点由于单体和印迹分子间的强相互作用 在印迹分子自组装或分子识别过程中的反应 结合和解离 速度慢 难以达到热力学平衡 不利于快速识别反应 而且识别能力与生物识别相差较大 预组装法分子印迹中常用的功能单体有含乙烯基的硼酸和二醇 含硼酸酯的硅烷混合物等 其中最具有代表性的是硼酸酯 其优点是能够生成相当稳定的三角形结构 而在碱性水溶液中或在有氮 氨气 哌啶 存在下则生成四角形结构 这种四角形的硼酸酯与二醇能极快地达到平衡 其平衡速度与非共价键作用相当 自组装法 self assembling 也称非共价型分子印迹法 是由瑞典Mosbach和其同事创立的 在自组装法中 印迹分子与功能单体之间靠弱的分子间相互作用力预先自组织排列 形成具有多重作用位点的非共价键单体 模板分子复合物 在交联聚合过程中 这种复合物的空间构型被固定下来 然后通过淋洗法去除印迹分子 得到分子印迹聚合物的方法 印迹分子与功能单体之间的分子间相互作用力主要是氢键 范德华力 静电相互作用 螯合作用 电荷转移相互作用等弱相互作用 优点由于印迹分子与功能基团的结合强度弱 所以 采用物理的萃取方法就可以将模板分子去除 如果在自组装和分子识别过程中只有氢键一种相互作用力 则这种分子印迹聚合物拆分外消旋体的效果较差 而如果在自组装和分子识别过程中除了氢键相互作用力外 还有其他弱相互作用力存在 则这种分子印迹聚合物拆分外消旋体的效果较好 如果在自组装和分子识别过程中只有静电相互作用力 则这种分子印迹聚合物的选择性较低 自组装分子印迹中常用的功能单体是甲基丙烯酸 它即可与氨基发生离子相互作用 也可与酰胺基或羧基发生氢键相互作用 两种方法比较 预组装法由于共价作用一般较强 在印迹分子预组装或识别过程中结合和解离速度慢 难以达到热力学平衡 不适合于快速识别 并且识别作用机理和生物识别相差甚远 发展缓慢 自组装法由于使用超分子作用制备仿生模型 其分子识别机理类似于天然生物分子 因而发展很快 分子印迹原理 模板分子与功能单体在合适分散介质中依靠相互作用力 如共价健 氢健 离子健 范德华力 疏水作用以及空间位阻效应等 形成可逆结合的复合物 加入交联剂 在光 热 电场等作用以及引发剂和致孔剂辅助下 形成既具有一定刚性又具有一定柔性的多孔三维立体功能材料 并且 将模板分子有规律的包在其中 合成后用一定方法把模板分子去除 从而获得与模板分子互补具有特异识别功能的三维孔穴 以便用于与模板分子再结合 如图所示 在分子印迹聚合物骨架上有与模板分子大小相同 在空间结构上完全匹配的空穴 而且空穴内原功能单体的功能基团在空间的位置也被固定 正好与模板分子相应的作用位点匹配 上述制备MIPs的操作就好像制作特定的模具一样 所以 那种被预先嵌入聚合物分子中 而后又被提取出来的目标分子常常被称作模板分子 这个三维的空间结构和功能单体的种类是由模板分子的性质和结构决定的 因为从不同的模板分子制备出来的分子印迹聚合物将具有不同的空穴大小 功能基团和基团的空间结构 所以 一种印迹聚合物通常只能与一种分子结合 即 一把钥匙只能开一把锁 这种三维空穴对模板分子将会产生特异的选择性结合 或者说预先制备好的这种模板将会对该模板分子产生专一性的识别作用 分子印迹聚合物的分子识别机理 分子印迹聚合物之所以能够选择性地识别模板分子或其类似物 主要是因为在用洗脱等方法除去聚合物中的模板分子后 在高度交联的聚合物中就留下了空间大小和构型都与模板分子匹配的具有多重作用位点的微腔 分子印迹的表征方法 MIPs性质的表征到目前还没有一个统一的理论描述 主要原因是因为MIPs的应用范围很广泛 在不同的应用领域 可以有不同的表征方法 例如在色谱固定相 手性分离和固相萃取应用中 一般用分离因子 分离度Rs 保留时间tR 结合常数KD 离解常数Ka 富集系数等来表征MIPs的选择性的好坏 而在化学传感器的应用中 则需要借用各种电化学参数如电流 电容 电导 电压以及各种光学参数和质量参数如光强度和质量等来表征 其转换装置有化学修饰场效应晶体管 光学积分仪 质量敏感装置如石英晶体微量天平和表面声波传感器 在催化应用领域则以催化效率 反应速度 结合量等参数来描述MIPs的催化活性 分子印迹技术在分离上的应用 色谱技术 固相萃取 层析 膜分离 化学仿生 异构体分离 分子印迹技术是为获得在空间结构和结合位点上与某一分子 印迹分子 完全匹配的聚合物和实验制备枝术 这就注定了它在分离中具有特定的选择性和高效的分子识别能力 分子印迹聚合物作为一种通过模板分子 功能单体和交联剂的相互作用人工合成的具有三维空间结构的受体 对模板分子有 预定 的识别能力 不仅有类似酶和抗体的特定的识别能力 还具有独特的化学 物理稳定性 有与高分子同样的抗腐蚀性能 其分子识别能力不受酸 碱 热 有机溶剂等环境因素的影响 制备简单 使用寿命长等优点 因此 它在许多领域展现了良好的应用前景 1 分子印迹技术在色谱分离中的应用分子印迹聚合物是制备色谱固定相 特别是制备手性固定相的良好的功能分子 可以用来制备高效液相色谱 毛细管电色谱和薄层色谱的固定相 主要用来进行手性异构体的拆分 这种将分子印迹技术用于色谱分离的方法被称作分子印迹色谱法 MIC MolecularImprintingChromatography MIC 是分子印迹聚合物在分离科学领域的最重要的应用 制备分子印迹聚合物色谱固定相时 除了模板分子 功能单体和交联剂外 还需要引发剂和致孔剂 MIPs固定相的制备与通常色谱固定相的制备方法类似 这时 可以将MIPs看成固定相功能分子 常用的聚合方法有以下几种 本体聚合先合成高交联度的分子印迹聚合物整体 再将聚合物研磨成微米级颗粒 然后采用适当的方法将模板分子抽提出来 即可用作色谱填料 这种色谱固定相主要用于HPLC和TLC 本体聚合法简单 但研磨很难得到形状规则的固定相颗粒 所以固定相的分离效率会受到影响 作为固相萃取小柱的填料则更合适 此法简便 直接 但是这种方法得到的聚合物颗粒较大 并且不够均匀 印迹效率不高 表面聚合即将MIPs分子连接到合适的载体颗粒表面 或者将MIPs膜包接到载体上 这样制备的色谱固定相主要用作HPLC 不过MIPs膜会堵住载体颗粒表面的小孔 使固定相的有效相互作用表面降低 蛋白质等生物大分子一般难以利用固定相表面的小孔 而只能进入大孔 所以表面MIPs膜包覆固定相比较适合印迹生物大分子 表面涂层是在硅胶载体表面涂上分子印迹聚合物 与表面聚合得到的固定相类似 只是MIPs分子是靠分子间相互作用吸附在载体表面 悬浮聚合采用种子悬浮聚合技术可以合成粒径分布很窄的分子印迹的聚苯乙烯颗粒 由于在悬浮聚合过程中通常使用的水乳液干扰分子印迹 得到的固定相颗粒的选择性下降 原位聚合即通过所说的在线整体柱技术 是在色谱柱管内直接合成MIPs固定相 原位聚合是一种新的色谱固定相技术 比较适合微柱和毛细管柱的制备 2 分子印迹技术在固相萃取分离中的应用固相萃取通常使用的萃取小柱是C18 C8 硅胶和离子交换树脂等填料 这些填料对很多性质类似的物质的分离选择性不高 尽管样品前处理对分离的选择性要求不是太高 但对于一些生物物质的分析 有时还是希望能选择性地从样品基体中将目标化合物分离或富集出来 MIPs对模板分子的特异选择性可以实现复杂基体中目标物的分离 为保证后续分析的准确性起到了关键作用 MIPs用于固相萃取分离的报道已经很多 如环境与农业样品中硝基酚 芳香硝基化合物 苯达松除草剂等的分离富集 生物样品如肠液中的胆固醇 体液中雌二醇和双酚A的分离 中药提取物中有效成分的分离等 3 分子印迹聚合物在层析上的应用分子印迹聚合物可用于层析固定相来分离对映体 对解决药物拆分具有很大的潜力 1986年Wulff小组利用预组装分子印迹的方法成功地制备出聚苯乙烯聚合物 分离了苯基甘露吡喃糖对映体 其分离系数Rs 2 1 而后他们利用梯度洗脱法使分离系数提高到4 3 Mosbaohl利用自组装聚合体系分离了苯丙氨酸衍生物 其分离系数Rs 1 2 而后又制备出分离N 乙酰基 L 苯丙酰基 L 色氨酸甲酯的分子印迹聚合物 其分离系数达17 8 目前很多药物已应用分子印迹聚合物得到拆分 4 分子印迹技术在膜分离中的应用膜分离具有处理样品量大 工业放大容易的特点 将膜分离的这些特点与MIPs的高选择性结合起来 就决定了用MIPs制备的分离膜将使分子印迹技术在分离领域的应用迅速扩展 因为MIPs的分子识别性质受酸 碱 有机溶剂和加热等环境因素的影响很小 所以MIPs膜与生物膜相比 除了机械强度更高外 还具有更高的稳定性 例如 以茶碱为模板分子的MIPs膜对茶碱的吸附量远大于咖啡因 这说明该MIPs膜对茶碱具有特殊的选择性吸附 5 分子印迹技术在化学仿生中的应用由于MIPs不受酸 碱 热及有机试剂等各种环境因素的影响 因此 用MIPs制备的传感器兼备生物传感器和化学传感器的优点 是未来传感器发展的方向 化学或生物传感器由分子识别元件和信号转换器 如电极 光极 场效应晶体管 压电晶体 热敏电阻等 组成 通常为了获得最大的响应和最小的干扰 或便于重复使用 一般将MIPs传感器的识别元件以膜或粉末形式通过适当的方式固定在转换器表面 6 分子印迹技术在对映体及异构体分离中的应用1992年美国食品和药物管理局 FDA 要求今后凡是新的光学活性药物都必须把光学异构体分离出来 分别测定其药物动力学和毒理学的各项指标 这就给分离对映异构体技术的改进提出了新的要求 目前尽管已有直接的手性合成 酶拆分和其它一些分离技术 但由于MIPs与酶相比具有不受各种恶劣环境因素的影响而又具有与酶相似的专一性和选择性 因此 分子印迹技术在分离对映异构体方面有其独到之处 目前有关MIPs的文献一半以上都是有关手性及异构体分离的 沙利度胺 反应停Thalidomide 谷氨酸衍生物 在生理ph条件下有二种旋光异构体 R 右旋 和S 左旋 R构型 有镇静作用 S构型 致畸有关 除了上述应用之外 分子印迹聚合物还用于制备模拟抗体代替天然抗体 总之 随着化学 生物学 材料学和分析技术的不断进步 分子印迹技术和分子印迹聚合物的研究会越来越深入 应用会越来越广泛 啤酒等很多饮料容易变质 其中一个 罪魁祸首 是饮料中所含的核黄素 又称维生素B2 德国多特蒙德工业大学利用核黄素四乙酸酯模板分子成功合成了一种分子印迹聚合物 它可以去除饮料中87 的核黄素 而目前常用的聚合物只能去除47 的核黄素 这项新技术已经在啤酒