电化学生物传感器.doc

电化学生物传感器 传感器与通信系统和计算机共同构成现代信息处理系统。传感器相当于人的感官,是计算机与自然界及社会的接口,是为计算机提供信息的工具。 传感器通常由敏感(识别)元件、转换元件、电子线路及相应结构附件组成。生物传感器是指用固定化的生物体成分(酶、抗原、抗体、激素等)或生物体本身(细胞、细胞器、组织等)作为感元件的传感器。电化学生物传感器则是指由生物材料作为敏感元件,电极(固体电极、离子选择性电极、气敏电极等)作为转换元件,以电势或电流为特征检测信号的传感器。图1是电化学生物传感器基本构成示意图。由于使用生物材料作为传感器的敏感元件,所以电化学生物传感器具有高度选择性,是快速、直接获取复杂体系组成信息的理想分析工具。一些研究成果已在生物技术、食品工业、临床检测、医药工业、生物医学、环境分析等领域获得实际应用。 根据作为敏感元件所用生物材料的不同,电化学生物传感器分为酶电极传感器、微生物电极传感器、电化学免疫传感器、组织电极与细胞器电极传感器、电化学DNA传感器等。(1) 酶电极传感器 以葡萄糖氧化酶(GOD)电极为例简述其工作原理。在GOD的催化下,葡萄糖(C6H12O6)被氧氧化生成葡萄糖酸(C6H12O7)和过氧化氢: 根据上述反应,显然可通过氧电极(测氧的消耗)、过氧化氢电极(测H2O2的产生)和pH电极(测酸度变化)来间接测定葡萄糖的含量。因此只要将GOD固定在上述电极表面即可构成测葡萄糖的GOD传感器。这便是所谓的第一代酶电极传感器。这种传感器由于是间接测定法,故干扰因素较多。第二代酶电极传感器是采用氧化还原电子媒介体在酶的氧化还原活性中心与电极之间传递电子。第二代酶电极传感器可不受测定体系的限制,测量浓度线性范围较宽,干扰少。现在不少研究者又在努力发展第三代酶电极传感器,即酶的氧化还原活性中心直接和电极表面交换电子的酶电极传感器。 目前已有的商品酶电极传感器包括:GOD电极传感器、L 乳酸单氧化酶电极传感器、尿酸酶电极传感器等。在研究中的酶电极传感器则非常多。(2) 微生物电极传感器 由于离析酶的价格昂贵且稳定性较差,限制了其在电化学生物传感器中的应用,从而使研究者想到直接利用活的微生物来作为分子识别元件的敏感材料。这种将微生物(常用的主要是细菌和酵母菌)作为敏感材料固定在电极表面构成的电化学生物传感器称为微生物电极传感器。其工作原理大致可分为三种类型:其一,利用微生物体内含有的酶(单一酶或复合酶)系来识别分子,这种类型与酶电极类似;其二,利用微生物对有机物的同化作用,通过检测其呼吸活性(摄氧量)的提高,即通过氧电极测量体系中氧的减少间接测定有机物的浓度;其三,通过测定电极敏感的代谢产物间接测定一些能被厌氧微生物所同化的有机物。 微生物电极传感器在发酵工业、食品检验、医疗卫生等领域都有应用。例如:在食品发酵过程中测定葡萄糖的佛鲁奥森假单胞菌电极;测定甲烷的鞭毛甲基单胞菌电极;测定抗生素头孢菌素的Citrobacterfreudii菌电极等等。微生物电极传感器由于价廉、使用寿命长而具有很好的应用前景,然而它的选择性和长期稳定性等还有待进一步提高。(3) 电化学免疫传感器 抗体对相应抗原具有唯一性识别和结合功能。电化学免疫传感器就是利用这种识别和结合功能将抗体或抗原和电极组合而成的检测装置。 根据电化学免疫传感器的结构可将其分为直接型和间接型两类。直接型的特点是在抗体与其相应抗原识别结合的同时将其免疫反应的信息直接转变成电信号。这类传感器在结构上可进一步分为结合型和分离型两种。前者是将抗体或抗原直接固定在电极表面上,传感器与相应的抗体或抗原发生结合的同时产生电势改变;后者是用抗体或抗原制作抗体膜或抗原膜,当其与相应的配基反应时,膜电势发生变化,测定膜电势的电极与膜是分开的。间接型的特点是将抗原和抗体结合的信息转变成另一种中间信息,然后再把这个中间信息转变成电信号。这类传感器在结构上也可进一步分为两种类型:结合型和分离型。前者是将抗体或抗原固定在电极上;而后者抗体或抗原和电极是完全分开的。间接型电化学免疫传感器通常是采用酶或其他电活性化合物进行标记,将被测抗体或抗原的浓度信息加以化学放大,从而达到极高的灵敏度。 电化学免疫传感器的例子有:诊断早期妊娠的hCG免疫传感器;诊断原发性肝癌的甲胎蛋白(AFP或FP)免疫传感器;测定人血清蛋白(HSA)免疫传感器;还有IgG免疫传感器、胰岛素免疫传感器等等。(4) 组织电极与细胞器电极传感器 直接采用动植物组织薄片作为敏感元件的电化学传感器称组织电极传感器,其原理是利用动植物组织中的酶,优点是酶活性及其稳定性均比离析酶高,材料易于获取,制备简单,使用寿命长等。但在选择性、灵敏度、响应时间等方面还存在不足。 动物组织电极主要有:肾组织电极、肝组织电极、肠组织电极、肌肉组织电极、胸腺组织电极等。测定对象主要有:谷氨酰胺、葡萄糖胺 6 磷酸盐、D 氨基酸、H2O2、地高辛、胰岛素、腺苷、AMP等。 植物组织电极敏感元件的选材范围很广,包括不同植物的根、茎、叶、花、果等。植物组织电极制备比动物组织电极更简单,成本更低并易于保存。 细胞器电极传感器是利用动植物细胞器作为敏感元件的传感器。细胞器是指存在于细胞内的被膜包围起来的微小“器官”,如线粒体、微粒体、溶酶体、过氧化氢体、叶绿体、氢化酶颗粒、磁粒体等等。其原理是利用细胞器内所含的酶(往往是多酶体系)。(5) 电化学DNA传感器 电化学DNA传感器是近几年迅速发展起来的一种全新思想的生物传感器。其用途是检测基因及一些能与DNA发生特殊相互作用的物质。电化学DNA传感器是利用单链DNA(ssDNA)或基因探针作为敏感元件固定在固体电极表面,加上识别杂交信息的电活性指示剂(称为杂交指示剂)共同构成的检测特定基因的装置。其工作原理是利用固定在电极表面的某一特定序列的ssDNA与溶液中的同源序列的特异识别作用(分子杂交)形成双链DNA(dsDNA)(电极表面性质改变),同时借助一能识别ssDNA和dsDNA的杂交指示剂的电流响应信号的改变来达到检测基因的目的。 已有检测灵敏度高达10-13g/mL的电化学DNA传感器的报道,Hashimoto等8采用一个20聚体的核苷酸探针修饰在金电极上检测了PVM623的Pat片断上的致癌基因v myc。电化学DNA传感器离实用化还有相当距离,主要是传感器的稳定性、重现性、灵敏度等都还有待于提高。有关DNA修饰电极的研究除对于基因检测有重要意义外,还可将DNA修饰电极用于其它生物传感器的研究,用于DNA与外源分子间的相互作用研究9,如抗癌药物筛选、抗癌药物作用机理研究;以及用于检测DNA结合分子。无疑,它将成为生物电化学的一个非常有生命力的前沿领域。 生物电化学所涉及的面非常广,内容很丰富。以上介绍的只是该交叉学科一些领域的概况。可以相信,随着相关学科的发展,生物电化学将进一步蓬勃发展。从上世纪60年代Clark和Lyon提出生物传感器的设想开始，生物传感器的发展已经距今已有40 多年的历史了。作为一门在生命科学和信息科学之间发展起来的一门交叉学科，生物传感器在发酵工艺、环境监测、食品工程、临床医学、军事及军事医学等方面得到了深度重视和广泛应用。随着社会的进一步信息化，生物传感器必将获得越来越广泛的应用。 一、生物传感器的定义与其发展历史回顾 作为生物，最基本特征之一就是能够对外界的各种刺激作出反应。其所以能够如此，首先是由于生物能感受外界的各类刺激信号，并将这些信号转换成体内信息处理系统所能接收并处理的信号。例如，人能通过眼、耳、鼻、舌、身等感觉器官将外界的光、声温度及其它各种化学和物理信号转换成人体内神经系统等信息处理系统能够接收和处理的信号。现代和未来的信息社会中，信息处理系统要对自然和社会的各种变化作出反应，首先需要通过传感器将外界的各种信息接下来并转换成信息系统中的信息处理单元（即计算机）能够接收和处理的信号。 生物传感器定义为使用固定化的生物分子(immobilized biomolecules)结合换能器，用来侦测生体内或生体外的环境化学物质或与之起特异性交互作用后产生响应的一种装置。生物传感器由两个主要关键部份所构成，一为来自于生物体分子、组织部份或个体细胞的分子辨认组件，此一组件为生物传感器信号接收或产生部份。另一为属于硬件仪器组件部份，主要为物理信号转换组件。因此，如何已生化方法分离、纯化甚或设计合成特定的生物活性分子(biological active materials)，结合精确而且响应快速的物理换能器(transducers)组合成生物传感器反应系统，实为研究生物传感器的主要目的。 生物传感器可以如上述的那样，依照其感受器中所采用的生命物质而称为组织传感器、细胞传感器、酶传感器等等，也可根据所监测的物理量、化学量或生物量而命名为热传感器、光传感器、胰岛素传感器等，还可根据其用途统称为免疫传感器。药物传感器等等。生物传感器中的信号转换器，与传统的转换器并没有本质的区别。例如，可以利用电化学电极、场效应管、热每器件、压电器件、光电器件等器件作为生物传感器中的信号转换器。依照信号转换器的不同，也可将生物传感器进行分类，如压电晶体生物传感器、场效应管生物传感器等。 生物传感器的发展，自1962年Clark和Lyon两人提出酵素电极的观念以后，YSI公司于七零年代即积极投入商品化开发与生产，启开了第一代生物传感器于1979年投入医检市场，最早的商品为血糖测试用酵素电极。YSI公司的上市成功与八零年代电子信息业的蓬勃发展有很密切的关系，并且一举带动了生物传感器的研发热潮。Medisense公司继续以研发第一代酵素电极为主，于1988年由于成功的开发出调节(mediator)分子来加速响应时间与增强测试灵敏度而声名大噪，并以笔型(Pen 2)及信用卡型(companion 2)之便携式小型生物传感器产品，于1988年上市后立即袭卷70%以上的第一代产品市场，成为生物传感器业的盟主。第二代的生物传感器定义为使用抗体或受体蛋白当分子识别组件，换能器的选用则朝向更为多样化，诸如场效半导体(FET)，光纤(FOS)，压晶体管(PZ)，表面声波器(SAW)等。虽然第二代的生物传感器，自八零年代中期即开始引起广泛的研发兴趣，但一般认为尚未达医检应用阶段，预定相关技术须待世纪末前方能成熟。目前可称的上第二代的生物传感器产品为1991年上市的瑞典商Pharmacia所推出的BIAcore与BIAlite两项产品。电化学生物传感器在水质安全监测中的应用王珂征1 ， 陈文2 (广州市怡文环境科技股份有限公司市场咨询部)摘要：电化学生物传感器对饮用水安全监测上有深远的意义和应用价值。近些年来，对于它的性能和检测方法的优化研究也越来越多。本文主要介绍电化学生物传感器的原理、类型及在水质监测领域的应用。关键词：电化学生物传感器饮用水安全监测前言饮用水安全问题，直接关系到广大人民群众的健康。“十一五规划”中明确指出“建立健全从水源地到供水末端全过程的饮用水安全监测体系”，2006年修订的生活饮用水卫生标准中将毒理指标由15项增加到74项，因此快速监测水中有毒物质成为水质在线自动监测系统发展的重点。传统的理化分析方法能定量分析污染物中主要成分的含量，但不能直接、全面地反映各种有毒物质对环境的综合影响。因水中有毒物质的多样性，实际中不可能对全部物质都分别实施检测，更不可能考虑到各种化学物质之间的拮抗、抑制和协同作用。而生物传感器可以综合多种有毒物质的相互作用，判定有毒物质的质量浓度和生物效应之间的直接关系，为水质的监测和综合评价提供科学依据，因而得到了迅速发展。生物传感器是以固定化细胞核、固定化酶技术为基础的新型传感器。根据用不同的基础传感器件，生物传感器可分为六大类型1：电化学生物传感器、介体生物传感器、热生物传感器、压电晶体生物传感器、半导体生物传感器和光生物传感器。近十年来，电化学生物传感器的研究工作取得了巨大的进步，其性能和种类也得到了很大的发展。电化学生物传感器的原理将具有分子识别功能的生物物质(酶、抗原、抗体、激素、细胞、细胞器、组织等)通过特殊加工技术涂敷固定在固态载体上(例如高分子膜等) 2，形成功能膜，当其与被测物质相接触时，膜内的感应物质首先与被测物质选择性地吸附形成复合物, 从而表现为化学变1 作者简介：王珂征（1978-）男2 通讯作者：陈文。TelEmail：返回化、热变化、光变化或直接产生电信号方式等。电极(固体电极、离子选择性电极、气敏电极等)作为转换元件，将物理信号转换成以电势或电流为特征检测信号的电信号，这些电信号与待测物质浓度成比例。电信号能够进一步被放大、处理或储存，然后利用电子仪器进行测量，记录，从而达到分析检测的目的3。其结构原理如下图1所示：图1. 电化学生物传感器基本结构图电化学生物传感器的分类根据作为敏感元件所用生物材料的不同，电化学生物传感器分为酶电极传感器、微生物电极传感器、电化学免疫传感器、组织电极与细胞器电极传感器、电化学DNA传感器等；根据基底电极的不同可以分为汞电极(主要是悬汞电极)和固体电极(包括半导体金属氧化物电极，金电极，碳电极等)4；根据生物材料的修饰(或固定)到电极上的方法不同，主要集中在共价键结合法、LB膜法、自组装膜法、化学免疫法、静电吸附结合法、表面富集法等。酶电极是最早研发的生物传感器，将酶固定在电极表面，探测电流型或电位型催化反应信号，酶的固定化是决定酶电极特性的关键技术。电流型酶电极基于探测生物催化反应中生成或消耗的电活性物质，大量的氧化还原酶、NAD+辅酶及脱氢酶可用于多种底物(葡萄糖、乳酸、乙醇、有机磷等)的检测，产生的过氧化氢和NADH很容易被检测；电位型酶电极利用离子敏电极、气敏电极、离子敏场效应管(ISFET)或光寻址电位传感器(LAPS)，通过检测生物催化反应导致的pH变化、氧化还原电位产生或消耗的离子(如NH4+)浓度或气体(O2CO2)浓度来检测底物。除了检测底物外，利用酶电极中酶活性受各种有毒物质的抑制作用来检测有毒物质(氰化物、有毒金属、农药等)。通过固定全细胞可增加传感器的稳定性和易活化特性，生化耗氧量BOD传感器就是一种微生物传感器。电化学免疫生物传感器利用电活性分子或酶标记抗原进行免疫检测，电流型和电位型电极均可用于该类免疫检测。生物材料功能膜电极检测器电势或电流 数据输出设备电化学生物传感器在环境监测中的应用用于监测BOD 的生物传感器生化需氧量(BOD) 是反映水体被有机物污染程度的综合指标，也是研究废水的可生化降解性和生化处理效果，以及生化处理废水工艺设计和动力学研究中的重要参数。采用BOD生物传感器可在1015min 检测出BOD的含量5，可对水质状况实行在线监测。其工作原理是以微生物的单一菌种或混合种群作为BOD微生物电极，由于水体中BOD物质降解代谢导致电极上微生物呼吸方式的变化，从而产生电信号，一定条件下传感器输出的电流值与BOD的浓度呈线性关系。张悦6等采用聚乙烯醇凝胶包埋方式固定酵母，并将固定化酵母直接分散悬浮在溶液中，将DO探头插人溶液中测量BOD。国外报道两种新的酵母菌种SPT1和SPT2被分离出来并且被固定在玻璃碳极上，以构成用于测量BOD的微生物传感器，其误差为土10%。还可以通过测量微生物氧化待测样品底物所产生的酸性物质来评估BOD值。对pH值敏感的晶体管和光伏特计被用来构造这种传感器。这种光伏特计传感器的检测时间约需要25min，微生物膜可以正常使用14星期以上。用于监测硫化物的生物传感器硫化物的测定在环境监测中居重要地位。目前常用的测定方法有亚甲基蓝比色法、碘量滴定法和电位滴定法等。这些方法往往需要对样品进行预处理，不但药品消耗量大，而且易造成测定误差。王晓辉7等用硫化物杆菌制成硫化物传感器。其原理是从硫铁矿的酸性土壤中分离、筛选出氧化硫硫杆菌，将其固定化，制备成微生物膜，再与氧电极组装成微生物传感器，将该微生物电极插入温度、体积、pH 及溶解氧浓度均恒定的缓冲溶液中，当膜内微生物的内源呼吸活性一定时，溶液中的氧分子通过微生物膜扩散进入氧电极的速率也一定。将含有S2 - 的溶液加入缓冲溶液， S2 -扩散进入微生物膜，并被膜内硫杆菌同化而耗氧，使氧分子扩散进入氧电极的速率降低，导致电极输出电流下降。通过对电流变化值的记录，可检测出S2 -的浓度。用于测定酚的生物传感器酚类属高毒物质，主要通过工业废水进入天然水体。酚类污染物涉及的领域非常广泛,是环境监测中十分重要的指标。测定酚的生物传感器主要有酶电极和微生物电极，它们都基于以下反应:苯酚O22 H+邻苯二酚邻苯二酚O2邻苯二醌两步反应均需要酪氨酸酶，据此可将酪氨酸酶与溶氧电极结合制成测定酚的生物传感器。穆冬燕8等研究了用麦芽糊精修饰的酪氨酸酶碳糊电极构成电流型生物传感器测水中酚类污染物质的方法，在pH为5.40的磷酸盐缓冲溶液中，苯酚浓度为2.010-71.010-5 mol/L的范围内电极电压与苯酚的浓度有良好的线性关系。检出下限为1.010-7mol/L，响应时间为2 min。此电极对其他酚类物质如邻苯二酚、对氯苯酚、邻甲酚等都有良好的响应。用于测定有机农药的生物传感器用于检测杀虫剂的最常见的酶是神经酶乙酰胆碱酶9，它能催化乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸。有机磷是杀虫剂中的一大分支，包括对硫磷、马拉硫磷、甲氟磷酸异丙酯等，它们能与酶结合成非常稳定的共价物磷酸基酶从而阻碍酶的活性。将固定化乙酰胆碱酯制成的生物传感器放入含有杀虫剂的试样中就可以测量出酶活性的抑制程度。干宁10等同时固定乙酸胆碱酯酶(AChE)及胆碱氧化酶(ChOx)于组装在丝网印刷电极表面的Fe3O4/Au纳米复合微粒上，构建了一类新颖的快速测定有机磷和氨基甲酸酯类农药的双酶传感器(AChE-ChOx/Fe3O4/Au SPCEs)。该双酶传感器电流响应在乙酸胆碱浓度为0.512.5 mmol/L之间呈良好线性关系(R2=0.998)。其对克百威(氨基甲酸酯类农药)和敌敌畏(有机磷类农药)的检测范围在0.051.00g/mL之间均呈良好线性关系(R2=0.977)，检测下限均可达0.01g/mL。应用于实际样品白菜的添加回收率在95%110%之间，与传统的生化法相比具有良好相关性。用于测定重金属的生物传感器重金属是指