转基因植物产品检测实验室一览.doc

转基因植物产品检测实验室一览序号仪器名称用途参考品牌型号与配置大大致预算1高速冷冻离心机生物样品的高速分离（冷冻保持样品生活活性）。德国eppendorf；美国Thermo；德国Sigma；德国Herolab。500001200002定性PCR扩增仪微量基因片段（DNA/RNA）的扩增德国Peqlab、美国ABI、德国eppendorf、美国Bio-rad。50000110000定量CR扩增仪（荧光定量PCR）扩增的同时对基因片段做定量检测。美国ABI、德国eppendorf、美国Bio-rad。2500007800003PCR专用工作台保证PCR时的无污染。（或建设标准的PCR层流实验室）德国Peqlab。（国产超净台也可替代。）10000340004电泳槽、电泳仪基因片段扩增之后跑凝胶。德国Peqlab、美国Bio-rad。或北京六一胶成像系统对凝胶进行分子量、等定性分析法国VL，美国Bio-rad、或国产。3500001500006紫外透射仪国产6000150007制冰机国产20000350008CO2培养箱美国Tehrmo。美国shellab20000500009液氮罐国产。40001000010超纯水美国millipore；美国Tehrmo。4000076000双蒸馏水发生器国产40001800011分子生物常用耗材与试剂50001000012转基因专用试剂500010000其他设备：细胞融合仪、核酸提取仪、紫外分光光度计、核酸蛋白检测仪磁力搅拌机杂交仪、-30低温冰箱、超低温冰箱、漩涡混合器、超声波细胞粉碎仪、自动恒温酶标。7 操作步骤7.1 抽样参照 NY/T672 转基因植物及其产品检测 通用要求和NY/T673 转基因植物及其产品检测 抽样。7.2 制样 参照 NY/T672 转基因植物及其产品检测 通用要求和NY/T673 转基因植物及其产品检测 抽样（按照GB 5491中四分法制备样品进行送检）。7.3 DNA模板的制备a 称取200-400 mg试样，在液氮中磨碎，装入已经用液氮预冷的1.5 ml离心管中。b 加入1ml预冷至4 的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静置5分钟，用13 000 r/min离心机，4 离心15 min，弃去上清液。c 加入600 l 预热到65 的抽提裂解液，用玻棒搅拌上下颠倒充分混匀，在65 的水浴锅中裂解40 min。d 用13 000 r/min离心机室温离心10 min，将上清液转至另一离心管中，加入5 l RNase A （10 mg/ml），37 水浴30 min。e 分别用等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）和氯仿：异戊醇（24：1）各抽提一次。f 用13 000 r/min离心机室温离心10 min，将上清转至另一离心管中。加入2/3体积异丙醇，1/10 体积3M乙酸钠（pH 5.6），-20 放置2-3 h，充分沉淀DNA。g 13 000 r/min，4 离心15 min，用70%乙醇洗沉淀一次，倒出乙醇，晾干DNA。加入50 l TE（pH8.0）溶解DNA。h 把DNA溶液浓度用重蒸馏水调制为100ng/l，储存于-20 备用。注意：I 1 g试样（如棉花种子）提取的DNA量应不小于200 g。II DNA的OD260/OD280的比值应在1.8左右，且OD260的值应在曲线的最高峰。7.4 PCR反应7.4.1 试样的PCR反应在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂, 用手指轻弹混匀，再加约50 L石蜡油（有热盖设备的PCR仪可以不加石蜡油）。每个试样3次重复。在台式离心机离心10s后，将PCR管插入PCR仪中。95变性5 min；进行35次循环扩增反应（Sad1基因、nos终止子、CaMV35S启动子：94,30 s；56,30 s；72,30s；cry1Ac基因、cry1Ab基因、以及cry1Ac与cry1Ab融合基因：94,1 min；56, 1 min；72, 1 min ）；然后72恒温7 min，取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或在4下保存。表1 PCR反应体系试剂终浓度单样品体积ddH2O31.2510PCR 缓冲液15 l25 mM MgCl22.5 mM5 l10 mM dNTPs0.2 mM1 l10 M Primer 10.5 M2.5 l10 M Primer 20.5 M2.5 l5 U/l Taq 酶0.025 U/l0.25 l100 ng/l DNA 模板5 ng/l2.5 l总体积50 l7.4.2 对照的PCR反应在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。阴性对照是指用非转基因抗虫棉花材料中提取的DNA作为PCR反应体系的模板；阳性对照是指用转基因抗虫棉花材料中提取的DNA作为PCR反应体系的模板；空白对照是指用无菌重蒸水作为PCR反应体系的模板。上述各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分与7.4.1相同。7.5 PCR产物的电泳检测将适量的琼脂糖加入1TAE缓冲液中，加热将其溶解，配制成琼脂糖浓度为2%（w/v）的溶液，然后按每100 mL琼脂糖溶液中加入5 L溴化乙锭溶液的比例，加入溴化乙锭溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1TAE缓冲液中，轻轻垂直向上拔去梳板。在每个泳道中加入适量的PCR产物（需和上样缓冲液混合，10 L-20L），其中一个泳道中加入DNA分子量标准，接通电源进行电泳，按2 V/cm 的电压电泳15-30 min。7.6 凝胶成像分析（照相）电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，轻轻地置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。如果通过PCR结果能够明确判定试样是或不是转基因抗虫棉，则样品检测结束；如果不能明确判定，则进行以下试验，见7.7、7.8和7.9。7.7 PCR产物的回收将100 l PCR反应液与上样缓冲液混合后，加入配制好的含2%（w/v）琼脂糖凝胶的泳道中，在其中的一个泳道中加入DNA分子量标准，接通电源进行电泳。其余步骤按PCR产物回收试剂盒说明进行。7.8 PCR产物的酶切鉴定 CaMV35S启动子扩增产物为195 bp，可以被限制性内切酶Xmn切成大小为80 bp和115 bp的两个片段。取15 L回收的PCR产物放入反应管中，加入1 L的限制性内切酶Xmn，再加入2 L反应酶切反应缓冲液，加水2 L配成20 L反应体系，在37恒温水浴保温反应3小时。将20 L反应液与上样缓冲液混合后加入配制好的2.5%（w/v）琼脂糖凝胶的一个泳道中，按7.5和7.6的步骤操作进行分析。7.9 PCR产物的克隆和测序对PCR产物片段按PCR产物回收试剂盒说明进行琼脂糖凝胶回收，连接到T-easy载体上，进行序列测定，并对测序结果进行比对和分析。8 结果分析与表述如果阳性对照的PCR反应中， Sad1内标准基因、CaMV35S启动子、nos终止子以及cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因基因这四个序列都得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而在阴性对照中仅扩增出Sad1基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作。否则表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。在PCR反应体系正常工作的前提下，检测结果通常有以下几种情况：（1）在试样PCR反应中，只要Sad1内标准基因以及cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因抗虫基因都得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明该样品为阳性结果，检出cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因。（2）如果在试样和阴性对照的PCR反应中，仅有Sad1内标准基因片段得到扩增，表明该样品为阴性结果，未检出转基因成分。（3）在试样PCR反应中， Sad1内标准基因得到了扩增，CaMV35S启动子、nos终止子或其中一种序列也得到了扩增， 且扩增片段大小与预期片段大小一致，但cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ac与cry1Ab融合基因都没有得到扩增，表明该样品为阳性结果，检出转基因成分。此时，要求研发者提供相应的靶基因序列以便进行进一步验证。转基因番木瓜的抗病性及分子鉴定对T1代转番木瓜环斑病毒(PRV)复制酶(RP)突变体基因的两个番木瓜株系,进行了抗病性和分子生物学分析.结果表明,转基因番木瓜对PRV抗性达到高抗或免疫,目的基因RP遗传至转基因后代并在RNA水平表达,PCR可检测到CaMV35S启动子序列、标记基因NPTII.作 者： 叶长明魏祥东陈东红蓝崇钰朱利民 作者单位：叶长明,魏祥东,陈东红,蓝崇钰(中山大学基因工程教育部重点实验室,生物防治国家重点实验室,广州,510275)朱利民(香港中文大学生物系,香港沙田)国家转基因植物检测与监测中心（华东）项目实验仪器设备（二）招标公告采购内容： （共四个组包）组包一 实时荧光定量PCR仪 1台基因扩增仪 1台高速冷冻离心机 台双向电泳仪 1台紫外分光光度计 1台组包二 高速台式离心机 1台组包三、 微量移液器（单道） 30支移液枪(8通道) 3支组包四、 人工气候箱 1台自动高压蒸汽灭菌锅 1台1. 正置荧光显微镜(1台)2. 超低温冰箱(2台)3. 44冷冻摇床(2台)4. 基因枪(1台)5. 放射性磷成像记录仪6. 放射性同位素检测、防护系统(1套)7. 同位素标记效率计数器8. DNA导入系统(1套)9. 高速冷冻离心机(含转子)(1台)10. 微量紫外分光光度计(1台)11. 蛋白电泳、转膜和干胶仪PCR仪:MJ Research or Eppendorf公司生产的,PE公司的太贵了(5万RMB)核酸电泳仪:大,中,小型号的各一套,北京六一仪器厂的足矣 (2000RMB)超净工作台:江苏生产的很好(8000RMB)摇床:江苏太仓生产,可做培养箱用,最好另买一台专做培养箱用(3000RMB)水浴摇床: 可能用不着水浴锅: 37C, 42C, 65C各一套, 国内生产的足矣(3000RMB)冰箱:4C, -20C,海尔,美的等国内生产都很好(5000RMB)超低温冰箱:-80C,日本SANYO等,国内好象没生产(不清楚价格)蛋白电泳仪:北京六一仪器厂的可以用,有钱可考虑买Amersham(配电转移设备) or Bio-Rad的,但很贵(Amersham的Hoeffer小型的5万RMB, 中型或大型的更贵)离心机:台式的买上海安亭的就行了,低温离心最好买Beckma