制备色谱原版.doc

制备色谱技术与操作！ 下面是，我对制备色谱方面的一些主要问题的一个简单总结。请大家看看哪些需要补充，哪些地方不对，哪些表达要更清楚。1 制备色谱到底是什么？请介绍一下制备色谱？答；有些搞分析色谱的朋友，对制备色谱这个名词比较陌生。其实，在化学化工医药等广泛采用的层析法以及薄层色谱就是最为典型的制备色谱。下面对制备色谱中的一些常用概念做一下介绍。（1）分析色谱的目的，是分析出混合物中一个（或者几个）纯物质的含量。制备色谱的目的，是从混合物中得到纯物质。为了加快分离的时间与提高分离的效率，制备色谱的的进样品量很大，导致制备色谱柱子的分离负荷的相应加大，也就必须加大色谱柱填料，增大制备色谱的直径和长度，使用的相对多的流动相。然而，当色谱柱上样品负载加大的时候，往往导致柱效急剧下降而得不到纯的产品。制备色谱，要解决容量与柱子效果之间的矛盾，对重现性也要考虑。从经济上来说。制备色谱要争取少用填料，少用溶剂，要尽可能多的得到产品。（2）样品的前处理： 制备色谱柱子由于处理的样品多，比分析柱子更容易受污染，所以，必要的前处理就显得非常的必要。萃取、过滤、结晶、固相萃取等简单的分离方法，如果用得上，而且还不是很麻烦，就要尽可能多的采用以去掉杂质。（3）制备色谱柱的材质及其特点。下面介绍一下，制备色谱柱常用的材质及其特点。 各种规格的玻璃柱子在实验室里头很容易得到，而且价格低廉，但玻璃柱子致命的弱点是它能承受的压力很小，且非常容易破碎。当由于压力太小而导致流动相流速很慢的时候，高位液面或加高压空气（或者氮气）的采用是一个简单的解决办法。在底下加真空，也能在一定程度上解决这个问题。 不锈钢柱子具有良好的耐腐蚀、抗压力性能，但其价格相对很贵。如果，只有很小的分离任务且经费也允许，市面上直径为1cm的小型制备柱就是首选。 有机玻璃柱子也能抗压力耐腐蚀，相对不锈钢柱子而言，它是半透明的，可以看到液体的运行状态，对有色的物质其特点就更为突出。（4）固定相的选择： 硅胶、键合固定相（如C18）、离子交换树脂 、聚酰胺、 氧化铝、 凝胶等都可以作为色谱柱的填料。 有不少文献报道，对填料可以进行一下处理提高了分离效果，如，对硅胶进行的硝酸银（或缓冲液）处理。（5）装柱方法的选择 根据固定相颗粒度和柱子的尺寸，采用不同的装柱方法，往往装填越好分离效果越好。装柱效果跟填料的颗粒度关系很大，颗粒度的减少会导致装柱的难度。一般来说，颗粒直径小于2030um的固定相采用湿法装填。所谓“敲击装填”技术适用于颗粒直径大于25um的固定相。湿法的目的是迫使相对稀松的 固定相悬浆以高速装入色谱柱子，从而减少空隙的形成。然而，当柱直径大于20mm，所加压力为3040bar时，高压悬浆装填技术就变得十分复杂。为将小颗粒固定相装入更大得制备型色谱柱，可采用柱长压缩技术。这种方法，先将固定相悬浆（或偶尔是干填充物）装入柱中加压，利用物理方法将其压紧。压紧的方法有两种：径向压缩和轴向压缩。 湿法装柱需要一定的设备，在柱子填完后，应用有柱效的测量，对柱效低的柱子应该重填。作者：草甘膦（6）流动相的选择：除了和分析色谱同样的考虑外，在选用流动相时，要考虑色谱分离后面加有旋转蒸发等二次分离操作。一般来说，不宜采用高毒性溶剂，对多元溶剂要尽可能的少用。如果产品中含有大量溶剂，溶剂的纯度也要考虑在其中。 （7）加样的方法：可以采用以下方法之一进样。用注射器进样用旋转阀进样通过六通阀进样通过主泵进样通过辅泵进样固体上样（8） 泵的选用：生产制备色谱泵的厂商很多。根据有无脉冲、能承受的最大压力、控制的精度、售后服务等来选择泵。（9）检测器的选用： 一般的分析池的最大允许流速仅为5 mL/min 或者10mL/min。而专门的制备池的最大允许流速可为150mL/min。有时，采用旁路分离管，将少量流体导入分析池进行检测，是一个不错的办法，但其浓度的误差会相对较大。（10）组分保留时间的估计用分析柱子在同等色谱条件下（同样的固定相和流动相）测定保留时间后，按照单一组分的线流速（不是体积流速）一定，通过计算可以知道组分的大致保留时间区域。分析谱图的峰形状，对确定保留时间也有很大的参考价值。（11）产品的收集手工馏分收集费时费力，自动馏分收集器有很大的方便。许多实验室和工厂都采用了馏分收集器。（12）超载、边缘切割、中心切割、放大技术与非线性效用 在制备色谱中，因为没有必要达到分析色谱那样的分离度，可以在一定范围内大大加大进样的浓度和体积。在做分离的时候，也有一些分析色谱的时候，不能用到的技巧。因为篇幅关系，不在这里叙述。（13）柱转换技术 通过接头或者阀门，实现柱子的简单延长，或者比较方便地实现对其中一个（或几个）组分的精制。（14）比较新的制备色谱技术 模拟移动床可以连续进样，并可以利用边缘切割效用，而且采用了柱切换技术，能更好的利用溶剂和填料，已经应用于工业化生产。其理论和技术也日益完善。 迎头色谱、超临界流体色谱、逆流色谱环形色谱、气相制备色谱等在科研和工业生产中也得到了应用。1 问: 我想购买waters600用于分析和制备，对于其配备有什么好的建议。可以配一个PDA，另外加一个示差折光410，另外买几根制备柱就可以了。waters600的流速最大为20mL/min，一般可以配20mm ID的制备柱，一次分离10-100mg的样品，如果样品量更大，可以通过配件扩展到45mL/min，使用30mm ID的制备柱。另外为了保证馏分收集的准确性，最好配上Fraction II 馏分收集器。 如果样品数量很大，可以配2767 sample manager和ZQ MS, 同时做自动进样并通过MS或UV信号自动收集馏分。这样可以过夜自动运行。最大通量每天可以处理100-200个样品。2 问： 如何用制备色谱柱制备低含量的杂质？制备色谱柱为Zorbax SB-C18 9.4*250mm及gilson馏分收集器，色谱仪为Agilent 1100或LC-6A。想用其制备面积归一化法含量为0.05%左右的杂质，初步提纯后用高分辨的LC-MS进行定性分析。如何设定色谱条件，如流量，进样量，样品的浓度，切割点的设置，是否要浓缩，要求将95%以上的主峰切除。（主峰后有二个杂质靠得很近。）1 制备用的流动相最好等级高一点，否则流动相中的杂质会影响LC-MS分析。2使用馏分收集器时，延迟体积一定要计算精确，检测器的响应时间设到最小，否则都会影响收集的纯度和回收率。制备柱的流速一般与直径的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速为1mL/min，9.4mm制备柱用1*（9.4/4.6）2, 大约为4ml/min。进样量设到几个mg应该基本没有过载。进样样品浓度越高越好。假如进样10mg，理论计算0.05%的杂质大约只有5ug，显然浓度太低，最好是多做几次，合并馏分然后浓缩后做LC-MS分析。3 问： 我想用hplc分离一个简单的多肽,我应该选用什么样的流动相,还有他的梯度,还有选用什么样的柱子RP-HPLC,C18柱可以制备很少量的肽。如果用RP-HPLC，首先应该用同类型的分析柱子分析一下多肽含多少杂质，设置缓缓的梯度的分离样品，在根据分析柱子跑出的峰形，逐渐放大纯化的方法。4 问：TFA在缓冲液中是不是只起到调节pH的作用呢？TFA的浓度越高基线的漂移越厉害，那是不是说它的浓度在缓冲液pH允许的情况下越低越好呢？（1）TFA起到类似离子对的作用，一般浓度在0.05-0.1%，过高的浓度，会使溶液偏酸，长时间使用可能影响柱子寿命。（2）同时TFA可以抑制硅胶表面硅醇基，改善碱性化合物的峰型。有时0.1%TFA分离不好的话。可以考虑加大浓度到0.2%。但要注意用完后及时冲洗色谱柱。（3）走梯度时，因为走成基线漂移，但对制备的影响不大。5 问：样品如果溶解度太低如何上制备HPLC？（1） 了解一下样品的性质,根据其酸碱性,极性等性质，通过调节溶剂的pH值等, 以达到较好的溶解度（2）样品可能某种晶型难溶，这样可以加入其他溶剂（如丙酮等）以助溶。 （3）不是一定要用流动相来溶解样品，对溶解度差的样品，可以选择甲醇，THF或DMSO等溶解样品。特别是DMSO，对一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留，不会造成干扰。而且DMSO的洗脱能力很弱，一般不会影响峰型。（4） 可以固体上样。6 问：多肽的分离制备, 如何上量？如何增大分离度?反相HPLC应当是很好的分离小肽方法，用CH3CN或CH3OH：H2O（95：5）做流动相，看保留如何，若无保留，建议改用其他色谱方法进行分离。关于多肽的分离，首先要知道它的分子量大小，然后选择不同类型的填料，如孔径的大小。我们先在分析柱（4.6MM内径）上做一下实验,找到最大的分离度,这一过程的难度是最大的,要不断地改变流动相和固定相,然后再线性或非线性放大到制备,放大的倍数按分析柱的实验结果。分离后可以通过冷冻干燥得到固体。还可以考虑离子交换来分离多肽。7 问： 做柱层析时（国产大孔吸附树脂），怎么才能把洗脱液中的树脂残留物处理干净？ 大孔吸附树脂在上使用前，一般需要进行处理，方法包括用色谱纯的甲醇或乙睛洗到没有吸收；或树脂用乙醇浸泡2天，丙酮浸泡2天，然后用常规的酸，碱洗。再用丙酮回流二小时就可以用了。8 问：由分析型液相转为制备型液相，其色谱系统需作多大调整？是否可以按照柱体积折算只改变流速？其上样量多大为宜？（1）泵要换，流量要加大，压力可不变或减少；流通池要换体积更大的。（2）整个系统的管路要更换更粗的，否则压力太大,而且特别容易发生堵塞。对流通池后的管路，最好增加反压调节器，否则管路太短的话，反压小会导致流通池气泡，管路长的话会导致峰展宽。（3）检测器的响应时间和峰宽要设置合适，否则会导致收集时延迟体积的计算不准(4)上样量主要根据柱子的大小、样品的浓度、制备是否根据分析条件放大（例如制备柱是否还用分析用填料）；一般上样量与柱子直径的平方以及长度成正比。9 问：流动相中含有盐时，收集液该如何除盐？选用挥发性酸，碱或盐（如醋酸铵）是否会在挥干溶剂或冻干过程中直接除去？一般可以采用离子吸附的办法去掉（可以参考离子吸附有关技术）。但也是稍微麻烦的事情，最好，不加加酸碱盐，如果要加的话最好，要加挥发性的或者对产品或者检测没有干扰的。可用G25脱盐，它是安马西亚出的一种葡聚糖凝胶。交联度大孔径小,对小分子的无机盐保留较大,而对分子量较大的有机物没有保留从而可以将盐份脱除。另外采用挥发性的酸，碱时，一般会在干燥过程中直接除去，但如果样品也有酸碱性，可能会与这些挥发性酸碱形成一定比例的盐。10 问：制备型柱子柱压上升 柱效下降 怎么办？对高价值的制备柱来讲，延长柱子寿命是很重要的。一般要注意保护柱子，一般来说，制备柱子一般需要保护柱配套。下面是可能堵塞柱子的原因：（1）如果您所分离的样品中杂质较多而您在上样前没有经过过滤（0.45微米），一些颗粒性杂质会积聚在柱头造成柱压升高，（2） 也有可能是因为您所使用的流动向中含有缓冲盐的原因，结晶或发生化学变化而堵塞。可以把柱子冲一冲。（3） 流动相是否符合液相色谱的要求？是否过滤处理？。柱子再生处理办法如下：（1）依次用水，甲醇，四氢呋喃，氯仿，甲醇来冲洗柱子，每种溶剂5-10个柱体积。（2）如果效果不明显，将柱子按以上顺序反冲，一般将大大降低柱子效果，不到不要没有办法才采用。（3）如果效果还是不好，就需要打开色谱柱，超声波清洗筛片（这样也会使柱子效果下降）。必要时挖掉色谱柱内受污染部位，填入新的填料，还可用3个月。（填的时候小心，别重新污染柱子）11 问：制备柱柱跑干了影响柱效吗?如果时间不长的话,可以用流动相多冲几个小时.柱效不一定变化很大.如果时间太久,柱效一定变低. 具体造成影响有多大，要靠柱效测定来确定，而不是干柱时间的长短。如果跑干了，对于PUMP的影响可能还大些，所以最好先把管路中的空气抽走再说。一般说来，制备柱子跑干，属于操作失当。柱子闲置不用时，最好冲入甲醇或其他有机溶剂，一定要把两头堵住密封，这样保留的时间会较长。12 问：分析HPLC如何放大到制备型HPLC？在分析液相中色谱柱的典型进样量是微克级，甚至更低。样品量和固定相之比有的甚至小于1:10000。进样体积一般来说都大大小于色谱柱体积（小于1:100）。 在这种条件下，会达到很好的分离效果，峰形尖锐并且很对称。分析系统线形放大到制备型HPLC意味着使用直径更大的制备柱、更高的流速和根据色谱柱的长度增加进样量并保持样品浓度不变。峰形仍会保持尖锐而对称。这种方法需要大型的色谱柱和大量的溶剂来分离较少的样品，但这种方法从经济上一般不合适。在制备液相中，最大的区别就是超量进样。制备的分离峰形一般不可能仍会保持尖锐而对称，分析和制备是不同的概念。制备的首要概念是在达到纯化的基础上，降低成本，加快时间（提高效率）。一般说来，纯化的成本要高于生产粗产品的成本，所以，可以加大上样量，甚至过载，出现平头峰，而收集只集中在峰的一小部分，以来保证纯度，主要为了节省流动相和提高设备利用率。13 问：制备纯化蛋白、多肽，耗用流动相惊人，请问这些用过的流动相（乙腈，甲醇）可以重蒸使用吗？ 流动相用一般减压方法重蒸后，往往会形成有机溶剂和水会共沸，另外，由于减压蒸馏属于单次平衡，往往得不到100%纯度的溶剂，这会使溶剂的配置有一定困难，从而使色谱的重现性和分离度会发生一定的变化。如果要求不是很高的话，一般可以分析重蒸后馏分中的各组分含量，计算后再使用。要通过重蒸得到纯物质是极其困难的，必须采用精馏塔多级蒸发，单就设备投资和能耗来讲，实验室规模或生产规模的废液回收处理已经是得不偿失。其实，我们没有必要得到纯的物质。作者：草甘膦14 问：反相色谱分离纯化后，怎样除去流动相产品中的TFA和乙腈或其他杂质？ TFA是反相色谱分离中常用的添加剂。可以用冻干的办法去除，国外许多文献是这样报道的。还可以试试离子交换、凝胶层析、甚至透析和超滤，其中，离子交换层析效果比较好，还可以起到浓缩样品的作用。首先，冻干的办法应该可以几乎彻底地除去TFA和乙腈，药物实验前最好先检测一下冻干品中的残留量，只要不超过允许范围，这种办法是最最简单、有效的。其次，如果你的药物的分装量不大的话(25mmol/L的缓冲液4.柱污染 每天冲洗柱5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命 采用保护柱(二) 保留时间缩短1.流速增加 检查泵,重新设定流速2.样品超载 降低样品量3.键合相流失 流动相PH值保持在37.5检查柱的方向4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加 柱恒温(三) 保留时间延长1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.键合相流失 同前(二)34.流动相组成变化 同前(二)45.温度降低 同前(二)5(四) 出现肩峰或分叉1.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏更换进样器转子(五) 鬼峰1.进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物处理样品3.柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相)通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六) 基线噪声1.气泡(尖锐峰)流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声)清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声更换氘灯4.电干扰(偶然噪声)采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡流动相脱气,加柱后背压(七) 峰拖尾1.柱超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4同前(四)45.同前(四)35.同前(四)36.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八) 峰展宽1.进样体积过大同(四)12.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载进小浓度小体积样品药物分析实验数据处理实验数据中各变量的关系可表示为列表式，图示式和函数式。 列表式：将实验数据制成表格。它显示了各变量间的对应关系，反映出变量之间的变化规律。它是标绘曲线的基础。图示式：将实验数据绘制成曲线。它直观地反映出变量之间的关系。在报告与论文中几乎都能看到，而且为整理成数学模型（方程式）提供了必要的函数形式。 函数式：借助于数学方法将实验数据按一定函数形式整理成方程即数学模型。熟悉相关和回归的定义，相关系数的定义，直线回归的最小二乘法。 熟悉药品质量标准分析方法验证中各项指标的定义和考察方法。 含量测定方法的评价 (效能指标分析品质因数) 一般常用的分析效能评价指标包括：精密度、准确度、检测限、定量限、选择性、线性与范围、重现性、耐用性等；测定法的效能指标可评价分析测定方法,也可作为建立新的测定方法的实验研究依据。 1.精密度系指用该法测定同一匀质样品的一组测量值彼此符合的程度。它们越接近就越精密。在药物分析中，常用标准(偏)差(SD或S)； 相对标准(偏)差(RSD)，也称变异系数(CV)，表示。 生物样品分析时，常用RSD表示精密度，并可细分为批内(或日内)精密度及批间(或日间)精密度。 批内精密度：是同一次测定的精密度。通常采用高、中、低三种浓度的同一样品各7-10份，每种浓度的样品按所拟定的分析方法操作，一次开机后，一一测定。计算每种浓度样品的SD值及RSD值。批内精密度也可视为日内精密度。所得RSD应争取达到5以内，但不能超过10%。 批间精密度：是不同次测定的精密度。通常采用高、中、低三种浓度的同一样品，每种浓度配制7-10份，置冰箱冷冻。自配制样品之日开始，按所拟定的分析方法操作，每天取出一份测定，计算每种浓度样品的SD值及RSD值。批间精密度也可视为日间精密度。所得RSD应控制在15以内。 2.准确度是指测得结果与真实值接近的程度，表示分析方法测量的正确性。由于“真实值”无法准确知道，因此，通常采用回收率试验来表示。制剂的含量测定时，采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法作回收试验及计算RSD，还应作单独辅料的空白测定。每份均应自配制模拟制剂开始，要求至少测定高、中、低三个浓度，每个浓度测定三次，共提供9个数据进行评价。 回收率（平均测定值M -空白值B）/ 加入量A100 回收率的RSD一般应为2以内。 3.检测限(LOD)是指分析方法能够从背景信号中区分出药物时，所需样品中药物的最低浓度，无需定量测定。 LOD是一种限度检验效能指标，它既反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白(本底)值的高低。要根据采用的方法来确定检测限。当用仪器分析方法时，可用已知浓度的样品与空白试验对照，记录测得的被测药物信号强度S与噪音(或背景信号)强度N，以能达到SN2或SN3时的样品最低药浓为LOD；也可通过多次空白试验，求得其背景响应的标准差，将三倍空白标准差(即3空或3S空)作为检测限的估计值。为使计算得到的LOD值与实际测得的LOD值一致，可应用校正系数(f)来校正，然后依之制备相应检测限浓度的样品，反复测试来确定LOD。如用非仪器分析方法时，即通过已知浓度的样品分析来确定可检出的最低水平作为检测限。 4.定量限 (LOQ)是指在保证具有一定可靠性(一定准确度和精密度)的前提下，分析方法能够测定出的样品中药物的最低浓度。 它反映了分析方法测定低药物浓度样品时具有的可靠性。它与上述的检测限的差别在于：定量限要定量测定某一药物在样品介质中的最低浓度，且定量限规定的最低浓度应该符合一定的精密度和准确度的要求。确定定量限的方法也因所用方法不同而异。当用非仪器分析方法时，与上述检测限的确定方法相同；如用仪器分析方法时，则往往将多次空白试验测得的背景响应的标准差(即空白标准差)乘以10，作为定量限的估计值，继之，再通过分析适当数量已知接近定量限或以定量限制备的样品来验证。 5.选择性是指在样品介质中有其他组分共存时该分析方法对供试物质准确而专属的测定能力。 它与专属性的含义稍有不同。专属性是指一种方法仅对一种分析成分产生唯一信号；选择性则可对多种化学成分产生不同响应，而主要成分的响应可与其它响应区分。 因此，选择性是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的量度。在药物分析中考察一个分析方法的选择性时，应着重考虑杂质、降解产物、相关化合物以及制剂辅料等其他组分是否对被测药物的测定有干扰。一般，通过添加上述物质的样品与未曾添加的样品所得分析结果进行比较而确定。 6.线性与范围 分析方法的线性是在给定范围内获取与样品中供试物浓度成正比的试验结果的能力。换句话说，就是供试物浓度的变化与试验结果(或测得的响应信号)成线性关系。所谓线性范围是指利用一种方法取得精密度、准确度均符合要求的试验结果，而且成线性的供试物浓度的变化范围，其最大量与最小量之间的间隔，可用mgL mgL、 ugml ugml等表示。 线性与范围的确定可用作图法(响应值Y浓度X)或计算回归方程(Ya+bX)来研究建立。 测定样品时所有生物药物分析方法都必须同时作标准曲线。每次作标准曲线时，方法应与分析方法考核时完全一致。标准浓度应包括一定梯度的5-8个浓度(非线性者如免疫分析可适当增加)，每个浓度只需测定一次(免疫分析可测定两次并取均值)；标准曲线应覆盖样品可能的浓度范围，对于含量测定要求一般浓度上限为样品最高浓度的120，下限为样品最低浓度的80 (但应高于LOQ)；目前仍广泛采用相关系数(r)表示标准曲线的线性度、并控制r0.9900。对照品的LOQ必须包括在线性范围。 7.耐用性 是指利用相同的方法在各种正常实验条件下对同一样品进行分析所得结果的重现程度。 所谓各种正常实验条件，包括不同的实验室、不同的分析人员、不同的仪器、不同批号的试剂、不同的测试耗用时间、不同的分析温度、不同的测定日期等等。分析方法重现性的测定是通过在不同实验室由不同的实验者(操作和环境条件虽有差别但仍在规定的分析参数内)对同一样品的分别测试而获得的。 重现性 即是指在不同实验室中使用此种分析方法的精密度。是评价其保持不受参数微小变差影响的能力，并可作为正常使用的一个可靠性指标。 8. 与参比方法测得结果的相关程度的比较 由于生物样品中含有许多干扰测定的杂质，特别是与原型药物相似的代谢物常对药物的测定有影响。因此，除考察选择性外，有时还用参比方法对实际生物样品同时测定并进行比较。比较试验时，取若干份实际样品 (如病人服药后采取的血样)，用一个已证明有相当专属性和可靠性的方法与新建立的方法同时进行测定，以参比方法测得的药浓为横坐标(X)，以新建立方法测得的药浓为纵坐标(Y)作成散布图，并求出直线回归方程 (ya+bx)及相关系数 (r)。r最大值为1，表示两法完全相关(结果完全吻合)；r0时，表示两法完全不相关。一般要求两法的相关系数r095，而相关直线的斜率 (b) 应接近于1。评价一种分析方法的效能，一般根据方法的使用对象区别。有以下四种情况： A用于原料药中主要组分或制剂中有效组分含量测定的方法：除了检测限和定量限二项指标外，对精密度、准确度、选择性、线性与范围、耐用性等均应有所要求；B用于原料药中杂质测定或制剂中降解产物测定的方法又可分为两种：用于含量测定；要求是：除检测限和精密度指标不必要求外，对准确度、选择性、线性与范围、定量限、耐用性等均应有所要求； 用于限度检查。要求是：只对检测限、选择性和耐用性三项指标有所要求，其余均无需要求。 C用于溶出度测定的方法及药物释放度测定的方法，只有精密度和耐用性有所要求，其余项目均不作要求。 D用于生物样品中药物测定的方法，对精密度、准确度、检测限、选择性、可测线性范围、定量限、对生物样品的耐用性以及与参比方法测得结果的相关程度的比较等指标应有所要求。制备色谱技术与操作及实验经验1 制备色谱到底是什么？（1）分析色谱的目的，是分析出混合物中一个（或者几个）纯物质的含量。制备色谱的目的，是从混合物中得到纯物质。为了加快分离的时间与提高分离的效率，制备色谱的的进样品量很大，导致制备色谱柱子的分离负荷的相应加大，也就必须加大色谱柱填料，增大制备色谱的直径和长度，使用的相对多的流动相。然而，当色谱柱上样品负载加大的时候，往往导致柱效急剧下降而得不到纯的产品。制备色谱，要解决容量与柱子效果之间的矛盾，对重现性也要考虑。从经济上来说。制备色谱要争取少用填料，少用溶剂，要尽可能多的得到产品。（2）样品的前处理： 制备色谱柱子由于处理的样品多，比分析柱子更容易受污染，所以，必要的前处理就显得非常的必要。萃取、过滤、结晶、固相萃取等简单的分离方法，如果用得上，而且还不是很麻烦，就要尽可能多的采用以去掉杂质。（3）制备色谱柱的材质及其特点下面介绍一下，制备色谱柱常用的材质及其特点。各种规格的玻璃柱子在实验室里头很容易得到，而且价格低廉，但玻璃柱子致命的弱点是它能承受的压力很小，且非常容易破碎。当由于压力太小而导致流动相流速很慢的时候，高位液面或加高压空气（或者氮气）的采用是一个简单的解决办法。在底下加真空，也能在一定程度上解决这个问题。不锈钢柱子具有良好的耐腐蚀、抗压力性能，但其价格相对很贵。如果，只有很小的分离任务且经费也允许，市面上直径为1cm的小型制备柱就是首选。有机玻璃柱子也能抗压力耐腐蚀，相对不锈钢柱子而言，它是半透明的，可以看到液体的运行状态，对有色的物质其特点就更为突出。（4）固定相的选择硅胶、键合固定相（如C18）、离子交换树脂 、聚酰胺、 氧化铝、 凝胶等都可以作为色谱柱的填料。 有不少文献报道，对填料可以进行一下处理提高了分离效果，如，对硅胶进行的硝酸银（或缓冲液）处理。（5）装柱方法的选择 根据固定相颗粒度和柱子的尺寸，采用不同的装柱方法，往往装填越好分离效果越好。装柱效果跟填料的颗粒度关系很大，颗粒度的减少会导致装柱的难度。一般来说，颗粒直径小于2030um的固定相采用湿法装填。所谓“敲击装填”技术适用于颗粒直径大于25um的固定相。湿法的目的是迫使相对稀松的 固定相悬浆以高速装入色谱柱子，从而减少空隙的形成。然而，当柱直径大于20mm，所加压力为3040bar时，高压悬浆装填技术就变得十分复杂。为将小颗粒固定相装入更大得制备型色谱柱，可采用柱长压缩技术。这种方法，先将固定相悬浆（或偶尔是干填充物）装入柱中加压，利用物理方法将其压紧。压紧的方法有两种：径向压缩和轴向压缩。 湿法装柱需要一定的设备，在柱子填完后，应用有柱效的测量，对柱效低的柱子应该重填。（6）流动相的选择除了和分析色谱同样的考虑外，在选用流动相时，要考虑色谱分离后面加有旋转蒸发等二次分离操作。一般来说，不宜采用高毒性溶剂，对多元溶剂要尽可能的少用。如果产品中含有大量溶剂，溶剂的纯度也要考虑在其中。 （7）加样的方法 可以采用以下方法之一进样。用注射器进样用旋转阀进样通过六通阀进样通过主泵进样通过辅泵进样固体上样（8） 泵的选用生产制备色谱泵的厂商很多。根据有无脉冲、能承受的最大压力、控制的精度、售后服务等来选择泵。（9）检测器的选用一般的分析池的最大允许流速仅为5 mL/min 或者10mL/min。而专门的制备池的最大允许流速可为150mL/min。有时，采用旁路分离管，将少量流体导入分析池进行检测，是一个不错的办法，但其浓度的误差会相对较大。（10）组分保留时间的估计用分析柱子在同等色谱条件下（同样的固定相和流动相）测定保留时间后，按照单一组分的线流速（不是体积流速）一定，通过计算可以知道组分的大致保留时间区域。分析谱图的峰形状，对确定保留时间也有很大的参考价值。（11）产品的收集，手工馏分收集费时费力，自动馏分收集器有很大的方便。许多实验室和工厂都采用了馏分收集器。（12）超载、边缘切割、中心切割、放大技术与非线性效用 在制备色谱中，因为没有必要达到分析色谱那样的分离度，可以在一定范围内大大加大进样的浓度和体积。在做分离的时候，也有一些分析色谱的时候，不能用到的技巧。因为篇幅关系，不在这里叙述。（13）柱转换技术 通过接头或者阀门，实现柱子的简单延长，或者比较方便地实现对其中一个（或几个）组分的精制。（14）比较新的制备色谱技术 模拟移动床可以连续进样，并可以利用边缘切割效用，而且采用了柱切换技术，能更好的利用溶剂和填料，已经应用于工业化生产。其理论和技术也日益完善。 迎头色谱、超临界流体色谱、逆流色谱环形色谱、气相制备色谱等在科研和工业生产中也得到了应用。1 问: 我想购买waters600用于分析和制备，对于其配备有什么好的建议。答： vihig davvy可以配一个PDA，另外加一个示差折光410，另外买几根制备柱就可以了。waters600的流速最大为20mL/min，一般可以配20mm ID的制备柱，一次分离10-100mg的样品，如果样品量更大，可以通过配件扩展到45mL/min，使用30mm ID的制备柱。另外为了保证馏分收集的准确性，最好配上Fraction II 馏分收集器。 如果样品数量很大，可以配2767 sample manager和ZQ MS, 同时做自动进样并通过MS或UV信号自动收集馏分。这样可以过夜自动运行。最大通量每天可以处理100-200个样品。2 问： 如何用制备色谱柱制备低含量的杂质？制备色谱柱为Zorbax SB-C18 9.4*250mm及gilson馏分收集器，色谱仪为Agilent 1100或LC-6A。想用其制备面积归一化法含量为0.05%左右的杂质，初步提纯后用高分辨的LC-MS进行定性分析。如何设定色谱条件，如流量，进样量，样品的浓度，切割点的设置，是否要浓缩，要求将95%以上的主峰切除。（主峰后有二个杂质靠得很近。）答： vihig davvy 云帆1 制备用的流动相最好等级高一点，否则流动相中的杂质会影响LC-MS分析。2使用馏分收集器时，延迟体积一定要计算精确，检测器的响应时间设到最小，否则都会影响收集的纯度和回收率。制备柱的流速一般与直径的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速为1mL/min，9.4mm制备柱用1*（9.4/4.6）2, 大约为4ml/min。进样量设到几个mg应该基本没有过载。进样样品浓度越高越好。假如进样10mg，理论计算0.05%的杂质大约只有5ug，显然浓度太低，最好是多做几次，合并馏分然后浓缩后做LC-MS分析。3 问： 我想用hplc分离一个简单的多肽,我应该选用什么样的流动相,还有他的梯度,还有选用什么样的柱子答：yingmw zyhRP-HPLC,C18柱可以制备很少量的肽。如果用RP-HPLC，首先应该用同类型的分析柱子分析一下多肽含多少杂质，设置缓缓的梯度的分离样品，在根据分析柱子跑出的峰形，逐渐放大纯化的方法。4 问：TFA在缓冲液中是不是只起到调节pH的作用呢？TFA的浓度越高基线的漂移越厉害，那是不是说它的浓度在缓冲液pH允许的情况下越低越好呢？答：zyh skywalker（1）TFA起到类似离子对的作用，一般浓度在0.05-0.1%，过高的浓度，会使溶液偏酸，长时间使用可能影响柱子寿命。（2）同时TFA可以抑制硅胶表面硅醇基，改善碱性化合物的峰型。有时0.1%TFA分离不好的话。可以考虑加大浓度到0.2%。但要注意用完后及时冲洗色谱柱。（3）走梯度时，因为走成基线漂移，但对制备的影响不大。5 问：样品如果溶解度太低如何上制备HPLC？ 答：aaron 云帆 skywalker natura（1） 了解一下样品的性质,根据其酸碱性,极性等性质，通过调节溶剂的pH值等, 以达到较好的溶解度（2）样品可能某种晶型难溶，这样可以加入其他溶剂（如丙酮等）以助溶。 （3）不是一定要用流动相来溶解样品，对溶解度差的样品，可以选择甲醇，THF或DMSO等溶解样品。特别是DMSO，对一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留，不会造成干扰。而且DMSO的洗脱能力很弱，一般不会影响峰型。（4） 可以固体上样。6 问：多肽的分离制备, 如何上量？如何增大分离度?反相HPLC应当是很好的分离小肽方法，用CH3CN或CH3OH：H2O（95：5）做流动相，看保留如何，若无保留，建议改用其他色谱方法进行分离。关于多肽的分离，首先要知道它的分子量大小，然后选择不同类型的填料，如孔径的大小。我们先在分析柱（4.6MM内径）上做一下实验,找到最大的分离度,这一过程的难度是最大的,要不断地改变流动相和固定相,然后再线性或非线性放大到制备,放大的倍数按分析柱的实验结果。分离后可以通过冷冻干燥得到固体。还可以考虑离子交换来分l离 问： 做柱层析时（国产大孔吸附树脂），怎么才能把洗脱液中的树脂残留物处理干净？大孔吸附树脂在上使用前，一般需要进行处理，方法包括用色谱纯的甲醇或乙睛洗到没有吸收；或树脂用乙醇浸泡2天，丙酮浸泡2天，然后用常规的酸，碱洗。再用丙酮回流二小时就可以用了。8 问：由分析型液相转为制备型液相，其色谱系统需作多大调整？是否可以按照柱体积折算只改变流速？其上样量多大为宜？（1）泵要换，流量要加大，压力可不变或减少；流通池要换体积更大的。（2）整个系统的管路要更换更粗的，否则压力太大,而且特别容易发生堵塞。对流通池后的管路，最好增加反压调节器，否则管路太短的话，反压小会导致流通池气泡，管路长的话会导致峰展宽。（3）检测器的响应时间和峰宽要设置合适，否则会导致收集时延迟体积的计算不准(4)上样量主要根据柱子的大小、样品的浓度、制备是否根据分析条件放大（例如制备柱是否还用分析用填料）；一般上样量与柱子直径的平方以及长度成正比。9 问：流动相中含有盐时，收集液该如何除盐？选用挥发性酸，碱或盐（如醋酸铵）是否会在挥干溶剂或冻干过程中直接除去？一般可以采用离子吸附的办法去掉（可以参考离子吸附有关技术）。但也是稍微麻烦的事情，最好，不加加酸碱盐，如果要加的话最好，要加挥发性的或者对产品或者检测没有干扰的。可用G25脱盐，它是安马西亚出的一种葡聚糖凝胶。交联度大孔径小,对小分子的无机盐保留较大,而对分子量较大的有机物没有保留从而可以将盐份脱除。另外采用挥发性的酸，碱时，一般会在干燥过程中直接除去，但如果样品也有酸碱性，可能会与这些挥发性酸碱形成一定比例的盐。10 问：制备型柱子柱压上升 柱效下降 怎么办？对高价值的制备柱来讲，延长柱子寿命是很重要的。一般要注意保护柱子，一般来说，制备柱子一般需要保护柱配套。下面是可能堵塞柱子的原因（1） 如果您所分离的样品中杂质较多而您在上样前没有经过过滤（0.45微米），一些颗粒性杂质会积聚在柱头造成柱压升高，（2） 也有可能是因为您所使用的流动向中含有缓冲盐的原因，结晶或发生化学变化而堵塞。可以把柱子冲一冲。（3） 流动相是否符合液相色谱的要求？是否过滤处理？。柱子再生处理办法如下：（1）依次用水，甲醇，四氢呋喃，氯仿，甲醇来冲洗柱子，每种溶剂5-10个柱体积。（2）如果效果不明显，将柱子按以上顺序反冲，一般将大大降低柱子效果，不到不要没有办法才采用。（3）如果效果还是不好，就需要打开色谱柱，超声波清洗筛片（这样也会使柱子效果下降）。必要时挖掉色谱柱内受污染部位，填入新的填料，还可用3个月。（填的时候小心，别重新污染柱子）11 问：制备柱柱跑干了影响柱效吗?如果时间不长的话,可以用流动相多冲几个小时.柱效不一定变化很大.如果时间太久,柱效一定变低. 具体造成影响有多大，要靠柱效测定来确定，而不是干柱时间的长短。如果跑干了，对于PUMP的影响可能还大些，所以最好先把管路中的空气抽走再说。一般说来，制备柱子跑干，属于操作失当。柱子闲置不用时，最好冲入甲醇或其他有机溶剂，一定要把两头堵住密封，这样保留的时间会较长。12 问：分析HPLC如何放大到制备型HPLC量是微克级，甚至更低。样品量和固定相之比有的甚至小于1:10000。进样体积一般来说都大大小于色谱柱体积（小于1:100）。 在这种条件下，会达到很好的分离效果，峰形尖锐并且很对称。分析系统线形放大到制备型HPLC意味着使用直径更大的制备柱、更高的流速和根据色谱柱的长度增加进样量并保持样品浓度不变。峰形仍会保持尖锐而对称。这种方法需要大型的色谱柱和大量的溶剂来分离较少的样品，但这种方法从经济上一般不合适。在制备液相中，最大的区别就是超量进样。制备的分离峰形一般不可能仍会保持尖锐而对称，分析和制备是不同的概念。制备的首要概念是在达到纯化的基础上，降低成本，加快时间（提高效率）。一般说来，纯化的成本要高于生产粗产品的成本，所以，可以加大上样量，甚至过载，出现平头峰，而收集只集中在峰的一小部分，以来保证纯度，主要为了节省流动相和提高设备利用率。13 问：制备纯化蛋白、多肽，耗用流动相惊人，请问这些用过的流动相（乙腈，甲醇）可以重蒸使用吗？ 流动相用一般减压方法重蒸后，往往会形成有机溶剂和水会共沸，另外，由于减压蒸馏属于单次平衡，往往得不到100%纯度的溶剂，这会使溶剂的配置有一定困难，从而使色谱的重现性和分离度会发生一定的变化。如果要求不是很高的话，一般可以分析重蒸后馏分中的各组分含量，计算后再使用。要通过重蒸得到纯物质是极其困难的，必须采用精馏塔多级蒸发，单就设备投资和能耗来讲，实验室规模或生产规模的废液回收处理已经是得不偿失。其实，我们没有必要得到纯的物质。14 问：反相色谱分离纯化后，怎样除去流动相产品中的TFA和乙腈或其他杂质？ TFA是反相色谱分离中常用的添加剂。可以用冻干的办法去除，国外许多文献是这样报道的。还可以试试离子交换、凝胶层析、甚至透析和超滤，其中，离子交换层析效果比较好，还可以起到浓缩样品的作用。首先，冻干的办法应该可以几乎彻底地除去TFA和乙腈，药物实验前最好先检测一下冻干品中的残留量，只要不超过允许范围，这种办法是最最简单、有效的。其次，如果你的药物的分装量不大的话(100ug)，建议你用离子交换层析，最好装一个小一点儿的柱子，让含盐洗脱峰的蛋白浓度达10mg/ml以上，稀释后完全符合试验要求。如果用分子筛，考虑稀释，最好也先过一个离子交换。此外可以试试疏水层析。如果产品是碱的话，可能会形成TFA盐，这样通过上述方法就无法除去。一般可以用碱水洗，然后将产品萃取出来。或者在里面加入一定量的盐酸，再干燥后形成盐酸盐。15 问：同一种填料的分析柱、制备柱按线形放大公式套，分离度会不会变化？一般会有一定的变化，原因有以下几点（1） 制备柱的装填是否均匀，如不均匀则可能产生涡流扩散使各个组分的经过通道的直径不同、阻力不一样，停留时间不同，色谱峰可能变宽。（2） 如果样品在流动相中溶解度小，在制备色谱上会有不同的峰展宽。（3）如果样品在分析柱上有展宽或拖尾的现象，放大到制备柱上后峰的展宽和拖尾经常会非常严重，导致分离失败。16 问：制备色谱柱如何测柱效？可以选择几种物质，苯，甲苯，萘、蒽等的衍生物上柱，流动相一般用65-80%的甲醇/水，测定后根据保留时间计算塔板数。由于制备色谱的管路死体积一般比较大，很难得到和供应商相同的柱效。建议在制备柱开始使用时在自己的色谱上