酶促反应动力学-多底物动力学.ppt

第二节多底物反应及其动力学 一反应机制的分类 一 Cleland表示法的基本符号和概念 底物 依照底物与酶结合的顺序依次用A B C D表示产物 根据产物从酶上脱落的顺序用P Q R S表示游离酶 E F G抑制常数 KiA KiB KiP KiQ米氏常数 KmA KmB KmP KmQ抑制剂 I修饰剂 X或Y反应分子数 Uni 单 Bi 双 Ter 三 Quad 四 酶反应中间物 分为两类 1 稳态中间物 指酶和底物以共价键结合形成的较为稳定的中间物 可以发生双分子反应而不能自身解离 例如 某些Ser蛋白酶在催化过程中形成的酰化酶中间物包括 共价结合的ES中间物 自由酶 2 过渡态复合物 非稳定的酶中间物 本身可以单分子解离或异构化之后再解离出产物或底物 分为 非中心复合物 酶未完全被底物饱和中心复合物 酶已经完全被底物饱和 EABEPQ EAEP 二 反应机制的分类和命名 以双底物双产物反应为例 1 序列 sequential 反应机制 酶必需与所有底物都结合之后才有产物放出 对于双底物双产物反应 必有酶 底物三元复合物形成 根据底物及产物与酶的结合及释放是否有序分为 1 有序双双双底物双产物反应 orderedBiBi ABPQEEA EAB EPQ EQEEA EQ 非中心复合物 EAB EPQ 中心复合物A 领先底物 B 随后底物 例如 许多以NAD 或NADP 为辅酶的脱氢酶类 乳酸脱氢酶 LDH 苹果酸脱氢酶 MDH 等NAD 苹果酸 MA 草酰乙酸 OAA NADHMAOAAEENAD ENAD ENADH ENADHENAD NADH形成外底物对机制 由于底物A与酶结合后改变了酶的构象 使原来隐蔽的B结合位点暴露 B才能结合上去 暗示 A与B可能结合在酶的不同部位 2 Theorell Chance T C机制 ABPQEEAEQE第二个底物B结合及释放非常快 没有明显的三元复合物变构过程 可看作是三元复合物浓度极低的序列有序机制 例如 马肝醇脱氢酶 NAD 乙醇乙醛NADHEENAD ENADHE 3 随机双双 randomBiBi ABPQEAEQE EAB EPQ EBAQP产物从酶上的释放及底物和酶的结合无一定顺序 少数脱氢酶和一些磷酸激酶属于该类 例如肌酸激酶 肌酸 ATP 磷酸肌酸 ADP机制 酶蛋白上的A B结合位均处于暴露状态 两者与底物的结合即互不干扰 也不互相依赖 EB EP 2乒乓机制 Ping PangBiBi 各种底物全部和酶结合以前 已经有一种或多种底物放出 不形成三元复合物 APBQE EA FP F FB EQ E属于该机制的酶大多数具有辅酶 如转氨酶 黄素酶等 谷草转氨酶属于典型的乒乓机制 AspOAAAKGGluE CHO E CHO AspE NH2 E NH2 AKGE CHO E NH2 OAA E CHO Glu 总结 有序机制序列反应机制T C机制随机机制乒乓反应机制 二King Altman法 速度方程图示法 一 Kappa表示法 E Ak1EA1k 12Vf k1 A E Vr k 1 EA Kappa 速度常数项 底物 产物 浓度项正向反应的Kappa 12 k1 A 逆向反应的Kappa 21 k 1反应速度 Vf 12 E Vr 21 EA 具有方向性 是一个矢量 其方向与酶形式的流向有关 二 King Altman法步骤 1 首先写出反应历程 然后将反应历程安排成封闭环形式 环的角数就是酶存在形式数目 用n表示 然后在各角之间连线上标出各步反应的 E Ak1EAk2EPk3E Pk 1k 2k 3Ek1 A EAk 1k 3 P k3k2k 2EP E k 1k3 k 1k 2 k2k3 EA k1k3 A k1k 2 A k 2k 3 P EP k 1k 3 P k1k2 A k2k 3 P E EA EP 2 画出King Altman图形 即 所有流向各种酶形式的n 1线矢量图 再将各步反应的 标到矢量图上 并写出流向各种酶形式的 乘积之和 3 速度方程推导 各种酶形式的浓度与其 乘积之和成正比 E E EA EA EP EP E0 E EA EP E E E0 E E E0 EA EA E0 EA EA E0 EP EP E0 EP EP E0 V k3 EP k 3 E P k3 EP k 3 P E E0 k1k2k3 A k 1k 2k 3 P E0 k 1k3 k 1k 2 k2k3 k1 k2 k 2 k3 A k 3 k 1 k 2 k2 P num1 A num2 P const coefA A coefP P num1 分子中 A 项之前的系数乘以 E0 num2 分子中 P 项之前的系数乘以 E0 const 分母常数项coefA 分母中 A 项之前的系数coefP 分母中 P 项之前的系数 三 注意 矢量图数目的计算 n 1线矢量图数目 m n 1 m n 1 n 角数 m 封闭环的线数 n 3 m 3 n 1线矢量图数目 3 3 3 1 3 3 1 King Altman图形不包含封闭环形式 E1E2E3E4n 4 m 5n 1线 3线 图数目 5 10个 4 1 5 4 1 2个封闭环形式无效 应去除 共有8个有效的King Altman图形 反应历程中有时可能没有逆反应 此时有些King Altman图形不存在 E Ak1EAk2EPk3E Pk 1k 2此反应若没有k 3线 则某些King Altman图形不存在 反应速度中凡是含k 3项者不存在 E k 1k 1k3k3k 2k2EA k1 A k1 A k3k 2k 3 P k 2EP k 1k1 A k 3 P k2k 3 P k2 E k 1k3 k 1k 2 k2k3 EA k1k3 A k1k 2 A k 2k 3 P EP k 1k 3 P k1k2 A k2k 3 P V k3 EP k 3 E P k1k2k3 A k 1k 2k 3 P E0 k 1k3 k 1k 2 k2k3 k1 k2 k 2 k3 A k 3 k 1 k 2 k2 P num1 A num2 P const coefA A coefP P 三双底物反应动力学 一 有序双双机制 1方程的推导 E Ak1EA Bk2 EAB EPQ k3EQ Pk 1k 2k 3k 4k4E QEk1 A EAk 1k4k 4 Q k 2k2 B k 3 P EQ EAB EPQ k3 n 4 m 4 则n 1线 3线 矢量图数目为4E EA EAB EQ V k4 EQ k 4 E Q k4 EQ k 4 Q E E0 num1 A B num2 P Q const coefA A coefB B coefP P coefQ Q coefAB A B coefAP A P coefBQ B Q coefPQ P Q coefABP A B P coefBPQ B P Q 若不考虑产物的影响 即 P 0 Q 0初速度V num1 A B const coefA A coefB B coefAB A B 2动力学常数的定义 最大反应速度 正向 Vmf num1逆向 Vmr num2coefABcoefAB米氏常数 KmA coefBKmB coefAcoefABcoefABKmP coefQKmQ coefPcoefPQcoefPQ解离常数 KiA constKiB constcoefAcoefBKiP constKiQ constcoefPcoefQ V num1 A B const coefA A coefB B coefAB A B num1 A B coefABconstcoefA coefA A coefB B coefAB A B coefAcoefABcoefABcoefABcoefABV Vmf A B KiAKmB KmB A KmA B A B 双底物反应中米氏常数的意义 KmA 是 B 饱和时酶对底物A的米氏常数KmB 是 A 饱和时酶对底物B的米氏常数 3有序机制动力学常数的求取 二次作图法 第一次为双倒数作图 一般固定其中一个底物的浓度 变化另一个 例如 固定 B 变化 A 将有序机制的动力学方程进行双倒数处理 1 KmA 1 KmB KiA 1 1 1 KmB VVmKmA B A Vm B 若将 B 固定于不同的浓度 则以1 V 1 A 作图可得一组相交于第二或第三象限的直线 其交点座标为 1 V 1 A B1 B2 B3 第二次作图 纵截距 1 B 作图由第二次的作图可知KmB和Vm 代入交点坐标中可知KmA若 A A饱和时 1 1 1 KmB VVm B 转化为米氏方程若 B B饱和时 1 1 1 KmA VVm A 这就是水解反应可看作是单底物反应的原因 因为另一底物是水 其浓度可看作是饱和 二 随机双双 1动力学方程推导 m 8 n 6 n 1 5线图 56个封闭环 24个有效图形 32个 假设反应过程第一个底物与酶结合或第一个产物从酶释放是迅速平衡过程 迅速平衡随机双双 V num1 A B num2 P Q const coefA A coefB B coefP P coefQ Q coefAB A B coefPQ P Q 若 P 0 Q 0则 V num1 A B const coefA A coefB B coefAB A B V Vmf A B KiAKmB KmB A KmA B A B 此方程与有序机制相同 称为序列机制的总方程 三 乒乓双双机制 1速度方程 乒乓机制的King Altman环形表达式为 Ek1 A EA FP k 1k4k 4 Q k2k 2 P EQ FB k 3Fk3 B m 4n 4 每种酶都有4种3线图 V num1 A B num2 P Q coefA A coefB B coefP P coefQ Q coefAB A B coefAP A P coefBQ B Q coefPQ P Q 若不计产物影响 P 0 Q 0 则 V num1 A B coefA A coefB B coefAB A B V Vmf A B KmA B KmB A A B 2 乒乓机制动力学常数的求取 1 双倒数图 若固定 B