生物测定方法.doc

生长量测定法体积测量法：又称测菌丝浓度法。通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。称干重法：可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10-20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1-5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105或100下烘干，或采用红外线烘干，也可在80或40下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。比浊法：微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。如我所使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600nm 处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.Coli的生长及诱导时间。菌丝长度测量法：对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度，或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管，到入合适的培养基，卧放，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录其菌丝生长长度，借此衡量丝状微生物的生长。微生物计数法血球计数板法:血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1 mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1 mm2面积上刻有400个小方格。通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1毫升菌液中所含的菌体数。这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。染色计数法：为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。比例计数法：将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。这种计数方法比较粗放。并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。液体稀释法：对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样，接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN（most probably number）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。平板菌落计数法：这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9cm的平板上出现50-500个菌落为宜。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。试剂纸法：在平板计数法的基础上，发展了小型商品化产品以供快速计数用。形式有小型厚滤纸片，琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基，其中加入活性指示剂2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，无色）待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养。短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量。试剂纸法计数快捷准确，相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。膜过滤法：用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品，经丫叮橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光，活细胞会发橙色荧光，而死细胞则发绿色荧光。生理指标法：微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化，例如酸碱度，发酵液中的含氮量，含糖量，产气量等，与生长量相平行的生理指标很多，它们可作为生长测定的相对值。测定含氮量：大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母为7.5%，霉菌为6.0%。根据含氮量6.25，即可测定粗蛋白的含量。含氮量的测定方法有很多，如用硫酸，过氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas测N2气法。Dumas测N2气法是将样品与CuO混合，在CO2气流中加热后产生氮气，收集在呼吸计中，用KOH吸去CO2后即可测出N2的量。测定含碳量：将少量（干重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或无机缓冲液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加热30分钟后冷却。加水稀释至5毫升，在580nm的波长下读取吸光光度值，即可推算出生长量。需用试剂做空白对照，用标准样品做标准曲线。还原糖测定法：还原糖通常是指单糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通过还原糖的测定可间接反映微生物的生长状况，常用于大规模工业发酵生产上微生物生长的常规监测。方法是，离心发酵液，取上清液，加入斐林试剂，沸水浴煮沸3分钟，取出加少许盐酸酸化，加入Na2S2O3临近终点时加入淀粉溶液，继续加Na2S2O3至终点，查表读出还原糖的含量。氨基氮的测定：方法是，离心发酵液，取上清液，加入甲基红和盐酸作指示剂，加入0.02N的NaOH调色至颜色刚刚褪去，加入底物18%的中性甲醛，反应数刻，加入0.02N的使之变色，根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量，可间接反映微生物的生长状况。其他生理物质的测定：P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及产酸，产气，产CO2（用标记葡萄糖做基质），耗氧，黏度，产热等指标， 都可用于生长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化，最终产气量，微生物活性三方面的测定反映微生物的生长。如我所在BMP-2的发酵生产上，随时监测溶氧量的变化和酸碱度的变化，判断细菌的长势。商业化快速微生物检测法：微生物的检测，其发展方向是快速，准确，简便，自动化，当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理，结合不同的检测方法，设计了形式各异的微生物检测仪器设备，正逐步广泛应用于医学微生物检测和科学研究领域。例如：1、抗干扰培养基和微生物数量快速检测技术结合解决了传统微生物检测手段不能解决的难题，为建立一套完整的抗干扰微生物检测系统奠定了坚实的基础。中科院广州分院合作产业处提供的抗干扰微生物培养基，新型生化鉴定管，微生物计数卡，环境质量检测试剂盒等，可方便的用于多项检测。2、BACTOMETER 全自动各类总菌数及快速细菌检测系统可以数小时内获得监测结果，样本颜色及光学特征都不影响读数，对酵母和霉菌检测同样高度敏感原理是利用电阻抗法（IMPEDANCE TECHNOLOGY）将待测样本与培养基置于反应试剂盒内，底部有一对不锈钢电极，测定因微生物生长而产生阻抗改变。如微生物生长时可将培养基中的大分子营养物经代谢转变为活跃小分子，电阻抗法可测试这种微弱变化，从而比传统平板法更快速监测微生物的存在及数量。测定项目包括总生菌数，酵母菌，大肠杆菌群，霉菌，乳酸菌，嗜热菌，革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌等。用分光光度计测微生物的OD值为什么要把波长设为600nm这个波长其实只是针对浊度，而分光光度计在600nm处对浊度的反应比较灵敏。测吸收峰的实际意义并不大，比如LB摇瓶培养过夜的大肠杆菌，其实在400多nm处的吸收最大，但那很可能是培养液的吸收峰，我问过某几个微生物杂志关于菌种鉴定等方面的资深审稿人（事实上我们在一个办公室），他说凡是文章里用测吸收峰来确定测浊度的波长，他都会退稿的。什么是OD600啊？OD600指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值。通过吸光值的定义可以知道，吸光值正比于溶液中的吸光物质的浓度。三楼说的仅仅是这个参数的一个应用，那就是利用细菌的吸光来测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况。比如，测量细菌培养液在600nm出的吸光值，得到的OD600数值如果在0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，OD6003表明细菌已经饱和等。OD600还有别的用途，比如浓度测定、酶活测定等。OD600是指菌体细胞密度.监测细菌的生长情况,可以通过测OD600来监测细菌的生长比较好的时期是在OD600为1时,此时可以进行转代等研究在细菌的培养中,OD600超过0.8就要稀释培养液!一般大肠杆菌菌液的密度是多少？取决于你的培养基、培养温度、培养时间和通气量（如为摇床，则为转速）等多方面条件，很难说的。以600nm光密度记，一般摇床培养12小时，LB液体培养基，OD600可以达到2-3，但是在发酵馆做高密度培养，能做到40-60个OD，这差距可是相当的大。为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度？采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度？如果在实验中需要测定大肠杆菌生长的0D值，你将如何选择波长?其实这个波长也不是绝对的，我们也有用过460 nm，600 nm等。一般来说测量光密度是用来测量浊度，通过浊度来表示菌的浓度。那么这个波长可以选择和菌液比较相似的颜色，这就和培养基、菌本身的颜色等等都有关系。比如在LB培养基培养的大肠杆菌一般可以用600 nm左右，但你用560 nm也无不可。另外这和仪器也有关系，最好是选择当前仪器能测量得比较准的那个范围的波长。 测OD值方法总结请问怎么测OD值啊,用紫外分光光度能测吗谢谢各位高手根据测OD时光的波长，波长在紫外范围就能够测，如果不在，就不能测量。非常感谢细履平沙.哪位能说的具体一点啊,我想测枯草芽孢杆菌的OD,我不太知道是在多少nm下测,我看过一些文献,上面说细菌大概600nm,还是我自己摸索吸收波长啊?另外是测吸光度还是透光率啊,空白用培养基做吗.请高人指点,谢谢了.一般测菌体密度的OD的波长范围是580nm-660nm我们那会儿测的(枯草芽孢杆菌)用600nm,已经属于可见光区空白如用水做,需要离心洗涤菌体,空白如用不接种的培养基做就不需要洗涤,但是不接种的培养基要和接种的同时培养,以求条件一致最后注意如果OD大于2.0,一般要稀释后再测,因为OD太大了,分光光度计的灵敏度就会显著降低一般都测吸光值，而且最好是整个实验过程中，保持发酵液或菌体的稀释倍数一致，吸光值与稀释倍数不一定成正比，可保证整个实验点有可比性一般OD值在控制在0 .1-0.4最好，在这个区内的值就可靠，最好不要超过1.0取值的时候要连续读数，重复3次的数最好。测菌体密度的OD的波长可以自己摸出来，看看用哪个波长有最大吸收就可以了。有合适的现场用的分光光度计推荐吗？要求只用作菌浓的OD值测定，哪种最便宜的分光光度计可以选择？DNA合成常见问题及解答Q: 怎样对合成DNA制品进行定量?A: DNA的量与260 nm处的吸光度值（OD值）成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的。1个OD值的合成DNA的重量约为33 mg。Q: 怎样理解测定的OD值?A: 进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。当测定200 ml溶液中的OD值为1.5时，溶液整体的OD量应该为多少？此时的OD值= 1.5 OD/ml 0.2 ml = 0.3 OD。Q: 合成Oligo DNA应怎样保存?A: 保存合成的Oligo应该注意以下几点：1. 干燥制品很稳定，常温下数个月无问题。但为保证万无一失，放置于-20保存为好。2. 溶解后的溶液DNA短期内（1-2周）使用可放置在4下保存，长期保存请放置于-20。溶解DNA时，请注意使用无菌、无核酸酶的水或TE Buffer。3. 荧光标记引物请避光保存。Q: 合成DNA溶液在室温下放置了数天，还可以使用吗?A: 溶液中的Oligo DNA常温下数天（3-4天）应该没问题，但最好不要放置一个星期以上。其寿命受溶液中的菌体、核酸酶等的影响。Q: 制品溶解后发现有少许沉淀，会影响实验结果吗?A: 所有的制品纯化后都要进行脱盐，脱盐是使用C18柱进行的，偶而会有微量的树脂溢出而进入制品。树脂不影响任何反应结果，请稍许离心后取上清使用。Q: 测定了制品的OD值后发现A260/A280 1.8，制品质量（纯度）合格吗?A: Oligo DNA和一般提取的双链DNA不同，A260/A280的比值不能准确衡量OligoDNA制品的质量，该比值依赖于序列中的各种碱基的组份，下表中列出了不同碱基组成的20mer的Oligo DNA的A260/A280比值。因此，如果您测定了A260/A280的比值小于1.8时，是由于上述原因引起的。Q: 为什么PAGE级和高纯度级制品的提供量比其他公司少?A: 无论是PAGE纯化，还是HPLC纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在2 OD左右。大OD量的提供对提高纯度是不现实，不科学的做法。一般，1 OD的20mer的DNA制品 (约5 nmol)，可以进行200-400 次的PCR反应 (50ml体系)，以及1,400次的测序反应。因此，2 OD 的DNA量可以足够进行一般的实验工作。Q: 我公司的DNA制品包装中为什么不提供电泳照片?A: 进行过Oligo DNA PAGE电泳的人员都知道，同一OD量的不同序列的DNA制品电泳时的泳带亮度（清晰度）是不一样的。原因在于EtBr等染色剂的染色是渗透至DNA的双链之间的，而合成的Oligo DNA是单链，Oligo DNA自身形成的立体结构越复杂，EtBr的染色就越容易，DNA带也就越亮。相反，有一些Oligo DNA由于不形成立体结构，根本就不为EtBr所染色。因此，我们认为有些公司对所有产品都提供差不多同一亮度的制品的电泳照片是非常不现实的做法。Q: 使用3%的Agarose凝胶电泳合成Oligo DNA制品，发现有很多条泳带，为什么?A: Oligo DNA的电泳一定要使用变性PAGE电泳。Oligo DNA是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带（更无法用Agarose电泳进行定量了)。Q: 进行PAGE电泳时，长度完全一样的Oligo DNA为什么泳带不在同一位置?A: 我们分析后认为主要有以下原因：1. A、G、C、T的组份不同，电泳速度不同；2. DNA的立体结构不同，电泳速度不同。这种情况在Oligo DNA越短时越容易发生，长链Oligo DNA之间差别较小。Q: PCR产物经克隆后测序发现，引物处的碱基有错误，为什么?A: 大部分厂家的说明是：1. PCR过程的错配；2. 克隆过程的突变。我们不能否认这种可能性，但这种可能性实在太小，几乎不可能。 对这种情况，我们经过了认真的分析，总结出了以下一些原因，供参考。1. 合成机管路的瞬时阻堵，造成化学反应的瞬间中断，其结果可能会发生单个(或一部分)碱基的缺失。2. 计算机程序失灵，控制错误合成。3. 合成过程中，碱基附加至DNA片段之前，碱基和碱基之间发生了偶联，然后再附加到了DNA片段上，造成多碱基现象。4. 合成时碱基G可能会转化成烯醇异构体，此时进行PCR反应时G会转变成A。5. 合成过程中的脱嘌呤作用，对脱嘌呤后的碱基DNA聚合酶不能识别，此时可能观察到A或G的缺失。嘌呤含量越高，就越容易发生这种情况。6. 不完全的脱保护结果。通常C脱得快，G脱得慢。不完全脱保护会发生碱基缺失。7. 合成过程中的Capping（盖帽）反应不完全，使短片段DNA继续参与合成，造成碱基缺失。应该说，上述这些情况发生的可能性都极低。然而，合成的DNA链越长，发生这种情况的机率也就越大。Q: PCR产物经克隆后测序发现，引物处的碱基有错误，怎么办?A: 1. 因为引物纯度不可能是100%，因此，挑选克隆时，有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。此时，请重新挑选一个克隆测序，也许结果会变好。2. 如果挑选2 3个克隆测序情况还没改观，我们会免费重新合成引物。进行蛋白表达实验数个月不成功，后经测序发现引物处有错误， 怎么办?1. 表达实验之前一定要对DNA序列进行验证，这是实验的常识。2. 我们可以免费重新合成引物。3. 如进行索赔时，按国际行业惯例，索赔范围限于制品价格范围之内。Q: 怎样才能保证Oligo DNA的正确性?A: 1. 合成Oligo DNA时，选用高纯度级制品。2. 避免使用大于50mer的长链Oligo DNA，最好选用小于35mer的合成DNA制品。3. 进行克隆实验时，每次克隆都须进行测序验证，以保证序列的正确性，然后再进行进一步实验。进行蛋白表达实验时，尤其需要注意。Q: Oligo DNA最长可以合成多少个碱基?A: 以每步反应效率为99%进行计算，粗略计算合成到100个碱基时，目的DNA片段的比例便为0 (精确数为37.0%)。但有些厂家曾报道合成了150mer的Oligo DNA片段。TaKaRa公司也曾合成过120mer左右的Oligo DNA制品。但根据我们的经验，要想保证合成DNA的碱基100%正确，Oligo DNA的长度最好不要超过70mer，80mer以上要想保证一个碱基不错就非常危险了，须十分注意。Q: 一般的合成Oligo DNA的5和3末端有P吗?A: 没有，5和3末端均为-OH基。如需要加P，订货时请特别注明，此时需收取加P (P修饰) 的费用。Q: 平端的PCR产物难以克隆，为什么?A: 由于一般的PCR用引物的5末端都没有P，因此，扩增后的PCR产物的5末端也没有P。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时，无法克隆进去；而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时，背景会极高。此时请对PCR产物的5端进行磷酸 (P) 化处理。Q: 合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办?A: PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。1. 引物和模板是否配对，同源性有多大?2. 引物本身是否有立体结构，或者二条引物之间是否形成高次结构?3. PCR反应用试剂是否能正常工作?4. PCR仪是否工作正常?5. PCR反应条件是否合适?如果一切正常，还无法解决问题时，我们可以免费重新合成引物。如果重新合成的引物也无法解决问题时，请把引物和模板寄送给我们公司，我们可以帮助摸索PCR反应条件。Q: 进行反义DNA (Antisense DNA) 实验时，是否要对DNA链全部进行S化修饰?A: DNA经S化修饰后比较稳定，在细胞中不会被核酸酶等分解。如果整条链全部修饰成S化DNA，的确能增加DNA的稳定性，但此时会降低DNA和目的模板结合的效率。因此，现在一般的科研人员通常采用将DNA片段两端的数个碱基进行S化修饰，这样既能取得保护DNA的效果，又能增加Antisense DNA和目的模板的结合能力。即使如此，现在还是有很多科研人员采用了全部S化的修饰方法，并且能得到非常良好的实验结果。因此，任何一项科研工作都不是绝对的，因根据具体情况设计实验方案。Q: Biotin标记有三种，它们之间有何不同?A: ss-Biotin可提供比较长的连接臂（臂长约24.3 A），方便了Biotin与Avidin间的结合，而且分子中含有S-S键，除可以用8M盐酸胍（pH1.5）分离Biotin与Avidin外，还可以使用还原剂（50mM DTT或100mM巯基乙酸）进行分离。Imino-Biotin可提供较短的连接臂（约13.5A），其最大特点是Biotin与Avidin的分离可在较温和的条件下进行；8M盐酸胍（pH4.0）。普通的Biotin提供与ss-Biotin相似长度的连接臂，但只能用8M盐酸胍（pH1.5）分离Biotin与Avidin。Q: FITC、6-FAM、5-FAM标记之间有何区别?A： 它们皆是荧光素标记（Fluorescein)，三者结构间的区别如下：从结构图可见，5-FAM与6-FAM互为异构体；而FITC则在与oligo的连接方式上（硫脲键）有别于前者（酰胺键)，但它们的发色团均为荧光素，通常使用中没有区别。微生物OD值是反映菌体生长状态的一个指标，OD是optical delnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度。通常400700nm 都是微生物测定的范围，需要紫外分光光度计测最大吸收波长。你是什么菌种？用得最多的就是505nm测菌丝菌体、560nm测酵母、600nm测细菌。 用