血红蛋白电泳的意义和判断ppt课件.ppt

ADULTANDNEWBORNHemoglobinscreeningwithcapillarys 1 目的 血红蛋白结构和功能的回顾SebiaCAPILLARYS2 Minicap血红蛋白检测说明血红蛋白临床结果说明 2 血红蛋白的结构 血红蛋白分子是由4条多肽链 2对 和4个可以结合铁和氧气的血红素 Normalhemoglobins containalpha beta delta andgammaglobinchains 3 三维结构 4亚单位2alpha链2alphagenes3 非 alpha链 beta delta gamma1bgene 1dgene 2ggenes 4 正常结果 HbA a2b2 HbF a2g2 HbA2 a2d2 琼脂糖凝胶Hydrasys Sebia 碱性缓冲液 成人 新生儿 5 血红蛋白遗传病类型 HEMOGLOBINOPATHIES 血红蛋白疾病血红蛋白性质变化 血红蛋白分子病结构异常 一个或数个氨基酸变异或缺失 都将会导致血红蛋白分子的电性发生改变常见血红蛋白变异体b globin S C DPunjab E 血红蛋白含量变化 地中海贫血合成或合成调控异常 bglobin bThalassemiasaglobin aThalassemias合并型 血红蛋白分子病Hemoglobinopathies 地贫Thalassemias 6 血红蛋白遗传病 遗传性疾病基因学图谱 正常基因 异常基因 7 异常血红蛋白类型 目前 已经证实的有超过1000种以上的变异体 a b gandd 大部分变异体出现频率较低 并且没有明显临床症状4种主要变异体 HbS HbC HbEandHbDPunjab 出现频率较高 特定人群 携带者会出现健康问题儿童可能在出生时即伴随有严重症状 8 血红蛋白疾病的区域分布图 Thalassemias 9 常见与地中海区域 意大利 西班牙 希腊 近东地区 非洲北部 同样常见于东南亚 泰国 印度 越南 中国 印尼 临床症状 Beta地贫重症型 严重贫血 需要长期输血治疗 Beta地贫中间型 Beta地贫轻微型 无临床症状 Beta地中海贫血 常见区域 bo没有Beta链合成b 合成能力下降 10 Alpha地中海贫血 临床症状 根据Alpha基因的表达状态 有4个不同程度的Alpha地贫症状 1个基因表达沉默 静止型 非常难检测到 在出生会测到HbBart s1 2 2个基因表达沉默 轻型alpha地贫 在出生会测到Bart s2 10 3个基因表达沉默 血红蛋白HbH病 出生时出现2 30 Bart s 儿童 成人出现10 15 HbH 4个基因表达沉默 HbBart s胎儿水肿综合征 死胎 常见区域常见与远东地区 非洲和地中海区国家 11 12 13 镰刀型红细胞血症 变异体出现在6GAG 谷氨酸 GTG 缬氨酸 14 C型血红蛋白分子病 变异体位置 AA6 GAG 谷氨酸 AAG Lys H t rozygotecomposite AC SC Chromosomes16 a2 a1 a2 a1 Homozygote Chromosomes11 H t rozygote d b d b A g A g G g G g d b d b A g A g G g G g Chromosomes16 a2 a1 a2 a1 SCheterozygotecompound Chromosomes11 Heterozygote d b d b A g A g G g G g d b d b A g A g G g G g 15 D型血红蛋白分子病 常见区域 常见于印度 特点 变异体位置b121Glu 谷氨酸 负电荷 Gln 谷氨酰胺 不带电荷 D LosAngeles D Punjab 6differentHbDaccordingtothepositionofthemutation 碱性缓冲液中 电荷下降 M电泳速度变度变慢 靠近HbS 临床症状 基因杂合体 无症状 仅在电泳中发现D区带 HbAfraction 65 70 HbDfraction 30 35 基因纯合体 轻微贫血HbAfraction absenceHbDfraction 100 16 E型血红蛋白分子病 常见区域 常见与东南亚地区 特点 变异位点b26Glu 谷氨酸 负电荷 Lys 赖氨酸 正电荷 碱性缓冲液 总体带电荷下降 凝胶电泳中 出现在HbC附近 临床症状 杂合体 无症状HbAfraction 65 70 HbEfraction 30 35 基因纯合体 轻微贫血HbAfraction absenceHbEfraction 100 17 下列情况下 需要进行血红蛋白检测 临床和遗传问题 产前诊断 贫血 小红细胞症新生儿筛查对来自地贫高发区人口 进行筛查 对诊断有帮助的其他信息患者临床症状 年龄 籍贯和其他相关的背景 输血记录 血液全套检测 网状细胞级别和进行细胞形态镜检Hb电泳 EDTA抗凝管 离子平衡和溶血情况 18 血红蛋白检测的几种方法 目前 血红蛋白检测步骤如下 电泳法对Hb进行检测或者使用等电聚焦电泳法 使用HPLC法进行确认 19 凝胶电泳结果识别表 20 等电聚焦电泳法 在pH梯度的凝胶片上 根据蛋白不同的等电点 对蛋白进行分离Hb电泳位置取决于缓冲液PH值蛋白电泳至其等电点位置后 停止泳动AtpI pH Hbdoesnothaveanetchargeandstopsmigrating电泳分离效果好 但时间长 需要经验丰富才能获得良好结果及进行结果判断 21 介于普通电泳和等电聚焦电泳之间的新方法 通过毛细管电泳法 即可以获得与IEF方法一样的分辨率 同时检测结果量值HbA2 HbF同样精确 出现异常变异体后 使用下列方法确认 ITANOtest solubilitytest HPLC液相色谱 Genotyping基因筛查 22 Capillarys2 Minicap 全自动毛细管电泳法进行血红蛋白检测Capillarys2 Minicap 23 毛细管电泳法原理 24 此时 电渗力 EOF 远远强于电场力 因此 蛋白被动从正极向负极端移动 正电极 EOF 负电极 Electromigration 蛋白电泳 DETECTION INJECTION 25 Capillarys Minicap血红蛋白电泳 血红蛋白条带 在电渗力的作用下 8分钟即完成电泳过程 然后 在415nm紫外光下被检测并显示出来 正常质控品必须在每天检测前使用Capillarys 检测速度 40样品 小时试管架1至7号位放置样品 8号位放4ml溶血素Minicap 检测速度 10样品 小时试管架1至26号位放置样品 27号位放溶血素 8个样品消耗5ml溶血素 26 Capillarys Minicap血红蛋白检测标本要求 抗凝管采血 EDTA heparin citrate 如果需要对输血患者采血 需要在输血前采集血液 使用去除血浆后的红细胞 隔夜或5000rpm 5分钟离心后样品 4 C以上 标本最多存放7天 需要长期存放 可以洗涤红细胞后 放置于 80 C 可存放至少3个月 27 CapillarysMinicap血红蛋白条带识别表 Capillarys Minicap区带识别表 Z15 HbHZ14 Z13 Hb JRovigo HbN Baltimore J KaoshiungZ12 HbBart s HbProvidence HbJ Mexico HbJ Baltimore Z11 HbKaoshiung NewYork denaturatedHbAZ10 HbHope HbM IwateZ9 HbA HbCamperdown HbPhnomPenh Z8 AcetylatedHbF HbAltanta HbAthens GAZ7 HbF denaturatedHbS HbPorto Allegre Z6 HbD Punjab HbPhiladelphia HbKorle Bu HbLepore HbK ln denaturatedHbE Z5 HbS HbHasharon HbHandsworth denaturatedHbO Arab Z4 HbE denaturatedHbC HbK ln HbA2variants M IwateHbA2variantsZ3 HbA2 HbO ArabZ2 HbC HbConstantSpring SetifHbA2variantZ1 HbdA2HbaA2 HasharonHbA2variant WinnipegHbA2variant 29 正常HbA2质控品 条带结果可录为QC 30 HbAFSC质控品 可用来作为参照曲线 便于异常结果的判断 31 HbsA F A2检测结果可通过颜色进行区分 异常区带显示为灰色 32 主要异常血红蛋白变异体 Z15 HbHZ12 HbBartZ10 HbHopeZ9 HbAZ7 HbFZ6 HbDPunjabZ5 HbSZ4 HbEZ3 HbA2Z2 HbC HbE HbS HbH 33 HbS变异体 HbA2正常值 6Glu Val HbA 2 2 HbS 2 S2 HbA2 2 2 34 Capillarys Minicap血红蛋白试剂优势 无需前处理 不需要洗血和溶血 直接检测血红蛋白C和E能从A2分离开根据S型和D型的细微电荷区别 进行区分 对于处于A和S之间的F给予个性化和聚焦的精确量化 对A2型血红蛋白有很好的分辨率和分离效果HbBarts和HbH可以很好的检测和量化糖化型血红蛋白电泳出现在主体峰内 不影响检测结果 35 异常结果分析 36 Case2 31YFemale 血红蛋白12 8 红细胞压积37 4 I A 84 1 F 1 5 A2 5 5 37 31YFemale Hgb12 8 Hematocrit37 4 II Alk Acid F S C A2 C S F thalassemia 轻型 A2 A A A A C P C P A 93 4 F 1 1 A2 5 5 38 HbA92 5 HbF2 6HbA24 9 HbF HbA HbA2 67YfemalefromTunisia Hgb9 1 hematocrit28 MCV62 小红细胞症 betathalassemia轻型 39 HbH4 HbA94 7 HbA21 3 HbA HbA2 HbH Child9Y fromLaos Hgb8 hematocrit27 9 MCV54 1 严重小红细胞症 血红蛋白H病 需要基因筛查 40 HbHandBart s Alpha thalassemia HBarts 41 Case1 13YMale Hgb8 1 Hct24 0 I A2 6 1 S 82 8 42 Case1 13YMale Hgb8 1 Hematocrit24 0 II Alk Acid F S C S A2 F C S F S HgbF S A2 4 6 betathalassemiaminor A2 A F A C P C P 43 Case2 65YMale Hgb9 4 Hematocrit27 3 I Co migrationwithA2 A 62 1 A2 31 7 44 Case2 HbEMigratesSeparatelyFromHbA2 26Glu Lys 45 21Y pregnantwoman Hgb13 1 hematocrit38 6 HbA95 HbF2 1 HbA22 9 Normalpattern HbFslightlyincreased pregnancy 46 Baby2monthsold fatherfromMartinique motherfromCentralAfrica Hgb11 hematocrit29 8 HbF49 5 HbS25 9 HbA21 8 HbC22 8 HbF HbS HbA2 HbC SCcompoundheterozygoty 47 Diabeticpatient 54Y Hgb14 5 hematocrit43 5 MCV88 HbA1cmeasurement HPLCTosoh HbA54 7 HbX41 7 HbA23 6 HbA HbA2 HbX Normalhemogram compatiblewithheterozygoteA D Tobeidentifiedbygenotyping 48 HbA51 8 HbA22 9 HbC35 9 HbA HbA2 HbC Diabeticpatient 61Y Hgb11 6 hematocrit34 8 MCV85 Slightanemia compatiblewithheterozygoteA CTobeidentifiedbygenotyping 49 Adoptedchild 4Y originatedfromHaiti Hgb10 9 Hematocrit31 3 MCV76 9 HbA97 5 HbA21 4 HbX1 1 HbA HbA2 HbX Slightanemia heterozygousDeltamutation asymptomatic 50 Diabeticpatient 73Y Hgb10 2 hematocrit30 8 MCV87 3 Alphachainmutation genotypingconfirmation HbWinnipega75AspTyr HbA Wi HbA2 Wi HbA HbA2 51 HbA90 3 HbF3 8 HbA25 9 HbA HbF HbA2 HbA64 HbS33 1 HbA22 9 HbA HbS HbA2 HbA2 2 HbF67 3 HbS29 1 HbA21 4 HbA HbF HbS HbA2 Father BetathalassemiaminorMother HeterozygoteAS Baby2monthsold AssociationS betathalassemia 52 HbLeporeonMinicap Capillarys N Ac A0 Lepore A1 HbA2 HbA HbF HbLepore AFSCcontroloverlaying 53 HbLepore b和d链重新组合形成 在碱性缓冲液下电泳 总体带电荷下降 电泳位置出现在S型血红蛋白附近 基因杂合体 HbLeporefraction 5 15 Clinicalsignsofminorbthalassemia 基因纯合体 HbLeporefraction about30 Clinicalsignsofhomozygousbthalassemia 常见区域 Lepore Boston Washington 常见于意大利人群 同样常见于在罗马尼亚 澳大利亚和墨西哥人群 特点 54 a47Asp His HbHasharon HbA HbA2 HbF HbHasharon HbHa A2 HbO Arab b121Glu Lys HbA2 O Arab HbF HbA 56 DIAGNOSTICFLOW CHART 57 ANEWFASTHEMOGLOBINELECTROPHORESISMETHODFORDRIEDBLOODSPOTSONSEBIACAPILLARYS AUTOMATEDSYSTEM 58 现有的新生儿血红蛋白筛查方法 SCD 新生儿血红蛋白检测 等电聚焦 IEF 高效离子交换液相色谱法 CE HPLC 毛细管电泳方法可取代常规 操作复杂的等电聚焦方法 59 新生儿血红蛋白快速检测法 取血板 BSD600全自动打孔器 全自动溶血 样品稀释和检测 条码识别 取血板条码 样品稀释杯条码 使用纯净水洗脱样品 60 与IEF方法比较 毛细管方法优势 对于常见异常血红蛋白变异体有100 区分能力 HbS C D E 对其他非常见变异体有良好检测能力对不同类型样品拥有相同检测能力 新生儿 早产儿或者进行过输血患儿样品全程检测溯源性 取血板和样品稀释杯使用条码高效性 48个样品 小时 576样品 天4小时人机分离操作 最多可进行3X192个样品检测可选择使用与毛细管匹配的全自动打孔机 完全自动化处理样品无需人工进行样品转移 避免交叉污染该项目检测完全自动化 从前处理到检测 直到结果分析 全程无需人工干预 61 使用标准取血板 在室温下进行干燥 干燥的取血板可在2 8 C下 保存1个月 新生儿血红蛋白检测的样品要求 通过颜色区分正常及异常样品 正常血样 withHbFandHbA acetylatedHbF 异常血样 63 提供样品检测完整溯源性 通过样品ID 试剂杯和全自动打孔器的数据记录完成数据交换 异常样品自动显示 64 电泳图谱说明 检测到条带的位置 图谱会自动定位 鼠标经过的区带位置 会显示出该区带的所有可能出现的异常血红蛋白名称 N1toN13 新生儿血红蛋白检测条带名称识别表 N13 HbBart sN12 N11 HbHope Gammachainvariants denaturedHbAN10 HbAN9 DenaturedHbFN8 N7 HbFN6 N5 HbD Punjab HbG Philadelphia HbKorle BuN4 HbS acetylatedgammachainvariantsN3 HbE HbF OuledRabah gammachainvariants MethemoglobinN2 HbA2 HbO Arab HbF OuledRabah gammachainvariantsN1 HbC 66 正常血样 Birth 19 01 06Samplecollection 24 01 06Term 39w Weight 3445g 67 输血后检测结果 Birth 29 01 06Samplecollection 01 02 06Term 38w Weight 3100g 68 F Shomozygote Birth 05 01 06Samplecollection 08 01 06Term 37w Weight 3490g HbS HbF DenaturedHbF 69 早产儿体内的F S DenaturedHbF HbF HbS Birth 20 02 06Samplecollection 23 02 06Term 34w Weight 1300g 70 F SCcompoundheterozygote DenaturedHbF HbF HbS HbC Birth 30 01 06Samplecollection 02 02 06Term 40w Weight 3900g 71 F ASheterozygote HbA HbF HbS Birth 16 12 06Samplecollection 19 12 06Term 36w Weight 2780g 72 F Chomozygote HbF HbC DenaturedHbF Birth 20 12 05Samplecollection 24 12 05Term 39w Weight 3160g 73 F ACheterozygote Birth 18 12 06Samplecollection 21 12 06Term 40w Weight 3035g 74 F ACinaprematurenewborn Birth 17 10 05Samplecollection 20 10 05Term 30w Weight 2330g 75 F ADheterozygote Birth 29 01 06Samplecollection 31 01 06Term 37w Weight 3280g 76 F Ehomozygote HbE HbF DenaturedHbF Birth 10 11 06Samplecollection 13 11 06Term 40w Weight 77 F AEheterozygote Birth 10 03 06Samplecollect