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黄芪纳米粉激活细胞端粒酶活性及细胞寿命的影响 刘晓燕 王九颂 1提要：目的：探讨黄芪纳米粉对激活端粒酶及延缓细胞衰老的作用机制 ，为黄芪纳米粉延缓衰老的研究开辟新的领域。 方法：黄芪纳米粉作用于人衰老型细胞 ，观察细胞生长分裂次数 ，生物化学染色方法鉴定细胞的衰老 ，再测定细胞前后端粒酶活性的变化。结果：黄芪纳米粉作用细胞后，能够明显促进细胞群体分裂倍增次数，衰老型细胞数量显著下降；测试后端粒酶活性明显上升。 结论 ：黄芪纳米粉很可能是通过激活细胞内端粒酶活性，使端粒酶重新开始工作，重新开始弥补端粒缩短DNA碱基对（bp）而继续增长端粒，从而增加细胞分裂次数及细胞活力。延缓了细胞的衰老。端粒酶再激活是细胞逃脱衰老的重要机制，也表明端粒酶在细胞生物钟中具有重要作用。 关键 词 ：黄芪纳米粉 端粒 端粒酶 细胞衰老 端粒生命时钟的发现，是生物学的大事件。近年发现细胞衰老与细胞内染色体端粒长度正相关。人类细胞的分裂潜力由细胞内染色体上端粒的长度决定。通常认为当端粒因分裂而缩短到临界长度时，细胞就停止了分裂。而端粒结构是由端粒酶来维持的，这是细胞的重要生命现象之一。正常细胞的分裂能力有限，当其经过一定的倍增之后，将进入衰老状态 ，称为为细胞衰老。从分子水平研究细胞老化及人类的衰老，是目前研究生物衰老机理的方向。本文通过测定黄芪纳米粉作用于人成纤维细胞后 ，细胞生长速率的变化、衰老细胞数目改变 、端粒酶活性等方面，初步揭示了黄芪纳米粉延缓细胞衰老和端粒酶活性的关系。 1 材料和方法 11 材料黄芪纳米粉为本室准备 ；ECL试剂盒 ，Xgal为 Promega公司产品 ；端粒酶活性检测用 TRAPELISA试剂 盒，Roche公司产品：TRIZOL试剂，DMEM培养基为 Gibco 公司产品 ；小牛血清 为 Hyclone公司产品 ；其他试剂均为进口和国产分析纯试剂 ， 12 方 法 121 细胞培养 细胞系来 自、胚肺组织 ，为二倍体成纤维细 胞。体外培养最多可分裂60-70代。一般认为30代以下为年 轻细胞，55代以上为衰老细胞。用含 10d牛血清、100unitsml 课题由学校生物学基金资助青霉素和 100pgml链霉素的 DMEM培养液培养。 122 细胞处理 待细胞处于生长对数期时(5060细 胞融合)，细胞用 DMEM 洗一次后 ，加 入相应体积的含 10 小牛血清 DMEM 和黄芪纳米粉，使得黄芪纳米粉的最终浓度 分别 为 10、20、40、80、120mgN，无黄芪纳米粉的细胞为对照。 123 生长曲线 接种 5000个衰老型成纤维细胞于 96孔 培养板中，按上述方法培养与黄芪纳米粉作用 ，每 48小时计数 1 次 ，连续 8天 ，绘制细胞生长曲线。 124 一半乳糖苷酶(pgN)染 色 按 Dimfi等建立的方 法进行 _6 。将成纤维细胞接种 于盖玻片上。在黄芪纳米粉作用 于不同时间后，PBS洗一次，用 40gL多聚 甲醛固定细胞 45min，用 X一半乳糖苷酶 (X一 )染液 ，37保温 48小 时。染液含 20mnlL X一 、40mmolL醋 酸 一磷 酸钠 (pH60)、5mnlL 铁 氰 化 钾 、5mmolL 亚 铁 氰 化 钾 、 150mnlL氯化钠 、2mnlL氯 化镁。室 温显色过 夜。衰 老细胞呈深蓝色，显微镜下计数 。 125 TRAPELISA实验 用 TRAPELISA试 剂盒进 行实验 ，方法见试剂盒说 明书。收集细胞 ，PBs洗一次 ，每管 210 个细胞 ，加入 201裂解液 ，冰浴 30min后 ，416000 g离心 20min，取上清紫外蛋 白定量。每管加入约 5 的 细胞裂解液 ，25出混合物 ，5 l内标引物 ，用无 DNAase的水 补至 50；25反应 30rain，然后 加热 94 ，灭活 5min后进 行 PCR反应 ，条件为：变性 94 30S，50 30S，7290S，循 环数 20，最后保温 10min。取样品和 内参对照 PCR产物各 25 l于 96孔板上 ，同时设空 白裂解液和样品灭活的对照 ， 每孔加入 10出变性液，室温 10min，样品一分为二，分别加人 101杂交液 T或 101杂交液 IS，混合后，加入预处理过的 96孔板 中，封 口，37300rpm 2hr；吸去杂交液 ，用 洗涤液 洗 3次后 ，加入 100I山 tiDIGm 工作液 ，300rpm，室 温 30min；去杂交液 ，洗 5次 ，加入 100ITMB底物溶液 ，300rpm 室温 20min；最后加人 100 终止液 ，在 30min内在 450nM 处测其光吸收值 ，按公式计算端粒酶 的相对活性 。 结果 21 黄芪纳米粉对细胞生长的影响 黄芪纳米粉作用于衰老成纤维 细胞(浓度为 120ragd1)，不 同时间后 ，消化细胞 ，进行计数 ， 绘制生长曲线。如图 1所示 ，黄芪纳米粉给药后 ，与对照组细胞 相 比，细胞的群体数 目明显增多 ，且随着给药时间的延长，其 作用越显著。结果说明 ，黄芪纳米粉可以增强衰老型成纤维细胞 的增殖能力，延缓细胞老化。 图 1 不同时间下黄芪纳米粉对衰老细胞增殖的影响 22 黄芪纳米粉对细胞衰老的影响 口一半乳糖苷酶是一种很好的 可用于体内外衰老研究的生物学标志-6J。p 的检测大多采 用组化染色方法 ，简单易行，是 目前应用较为广泛的方法。松花 粉作用于衰老成纤维细胞(浓度为 120mgd1)，不同时间后，消化 细胞，固定后用x一 染色测其 p一半乳糖苷酶活性，细胞呈深 蓝色的为衰老细胞(图 2)。实验发现，黄芪纳米粉作用后 ，对衰老细 胞进行计数，与对照组细胞相比，衰老细胞数 目明显减少，给药 时间越长 ，其衰老的细胞数 目较对照细胞越少。结果表明，松花 粉可以抑制组织细胞衰老，延长细胞寿命。 图 2 不同天数后黄芪纳米粉对细胞衰老数 目的影响 a：为对照组细胞 ，b：为黄芪纳米粉作用 8天后的细胞 ，c：为不同时间 后衰老细胞所占的百分数 23 黄芪纳米粉对端粒酶活性的作 用 hTERT是端粒酶 的催化亚基 ，与端粒酶的活性呈正 比关系 J，利用 TRAP ELISA方法又进一步检测 了细胞 内端粒酶 的活性。由图 3 可以看出，对照组细胞 的相对端粒酶活性很低，在黄芪纳米粉作 用于HepG2细胞 6天后，与对照组相比，其端粒酶活性均出 现不同程度的升高 ；120mgdl浓度 的黄芪纳米粉作用 6天后 ，其 端粒酶活性约为对照组 97倍 。以上结果说明 ，黄芪纳米粉作用于成纤维细胞能够通过激活 hTERT基因的表达，提高细胞 内 hTERT蛋 白含量从而导致端粒酶活性显著升高。 图 3 不同浓度黄芪纳米粉对端粒酶活性的影响 3 讨 论 近年研究表明，端粒和端粒酶在细胞复制性衰老中起着 重要作用。端粒是真核细胞染色体末端的重复 DNA序列， 其生物学作用是防止染色体DNA降解、末端融合、非正常重 组和染色体的缺失 。由于存在“末端复制问题”，随着细胞老 化，人体细胞端粒重复序列长度不断缩短，端粒缩短到一定长度，细胞就会停止分裂而走向衰老死亡。但端粒酶能够 由 自身的 RNA提供模板，来维持与染色体稳定至关重要的端粒结构 ，使细胞具有无限繁殖的能力。如果在正常体细胞 中 重建端粒酶活性 ，就可维持细胞的端粒长度，延缓细胞的衰老-8 J。端粒酶激活被认为是细胞逃脱衰老的重要机制。 黄芪纳米粉含有高达二百余种的营养成份，可抑制组织老化，抑制人体衰老，提高人体免疫能力，具有延缓衰老的作用引。 为此，本文研究了黄芪纳米粉与端粒酶的关系，初步探讨该中药 延缓衰老的可能机制。 黄芪纳米粉于正常衰老型成纤维细胞，通过测定细胞的生长曲线和衰老细胞的百分 比，与对照组 细胞相 比。明显提 高细胞群体倍增水平，且衰老型细胞数目明显减少，延缓衰 老细胞的群体死亡的发生，从而延长细胞的体外寿命 的生存 时间。实验发现：不 同浓度 的黄芪纳米粉作用 衰老型细胞 8天 后 ，其端粒酶活性也有不同程度的上升 ，对照组细胞几乎检 测不到端粒酶活性 ，而 120mgdl浓度的黄芪纳米粉作用 8天后，端 粒酶活性明显上升 ，约是对照组细胞的近 10倍。因