不同基质的中成药及保健制品中镇痛剂检测方法的研究.doc

不同基质的中成药及保健制品中镇痛剂检测方法的研究项目完成单位：国家兴奋剂及运动营养测试研究中心项目完成人： 吴筠 申力 杨声 朱绍堂 吴侔天 陆江海摘 要 采用酸水解、SEP-PAK C18小柱固体萃取、反提、脱水及衍生化等手段从复杂的基质中分离蛋白质、多糖、油脂、植物油等干扰组分，提取出有效的镇痛药成分，用GC/MSD法对镇痛类药物进行定性和定量分析。本方法从糖、膏基质液中的提取平均回收率： 77.7%;茶和淀粉剂基质中的提取平均回收率: 80.1%;蛋白粉中的提取平均回收率:78.5%;油类中的提取平均回收率72.5%;酒类中的提取平均回收率:77.2%,结果表明该方法提取率高,准确、灵敏、可靠。1 引言 随着科技的迅速发展和人民生活水平不断地提高.怎样增强免疫能力、强身健体、消除疼痛、疲劳和提高运动能力等已经成为公众关注的问题。近年来不断有种类繁多的不同基质的镇痛保健制品推出。许多运动员也都在使用这些产品。经过检测研究，发现部分产品为了追求明显的效果在产品中引进某些动植物药成份。这是我国卫生部对于保健制品严令禁止的，并且也不符合国际奥委会的规定。开展这方面的研究,建立相应的检测方法，这对于保护消费者的合法权益和身体健康，尤其是少年儿童的身体健康，确保运动员在获得良好的治疗效果并提高运动能力的同时不出兴奋剂问题，维护我国运动员在体坛特别是国际体坛的声誉，有着十分重要的意义。目前，由于许多镇痛的中成药、保健制品都是一些含有糖、油脂、蛋白、动植物成分和软膏剂基质的产品，用现有的尿样的分析方法难以有效分离，提取和回收率低。本课题在已有的研究基础上，用酸水解、SEP-PAK C18小柱固体萃取、反提、脱水等手段从复杂的基质中分离蛋白质、多糖、油脂、植物油等干扰组分，提取出有效的镇痛药成分，用GC/MSD法对此类药物进行定性和定量分析。本方法已成功地用于2004年雅典奥运会运动员服用运动营养品的检测。2 实验部分2.1 仪器： Agilent 5973N-6890 GC/MSD, 质量选择检测器，扫描范围：50650。分析柱为HP-5 MS固定相为交联甲基聚苯硅醚，长25m、内径0.2mm，膜厚0.33mm；C18固体柱（Water 公司）；旋转蒸发仪(EYELA)；电热鼓风干燥箱CS101-AB；三和松石混匀器；循环水式多用真空泵SHB-3。2.2 试剂： 甲醇、乙醚、正己烷、异丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯，碳酸氢钠，碳酸钾，氢氧化钠都是北京化学试剂公司的产品，以上都是分析纯试剂。半胱氨酸，MSTFA，MBTFA均是Sigma产品。混合标品液:准确量取浓度为1 mg/ml的镇痛新(pentazocine PE)、可卡因(cocaine CA)、美散痛(methadone ME)、吗啡(morphine MO)、哌替啶(petidine PT)、可待因(codeine CD)、双氢可待因(dihydrocodeine DH)、乙基吗啡(ethylmorphine EM)、安侬痛(anadol AD)各10g,溶入5ml甲醇中。2.3 样品制备：取50l混合标品液，放入10ml螺口试管中，在60C氮气下吹干，加入基质，加水配成5ml溶液1。2.4 仪器条件：载气:高纯氦气,流速为0.9mL/min(温度为180C时)，分流进样，分流比为1:10，进样口温度250C，接口温度290C，离子源温度230C，电子能量70eV，升温程序:180C，以10C/min升至220C，又以5C/min升至260C，再以10C/min升至280C，保留10分钟。2.5 样品提取：1）含糖、膏基质液:取上述溶液1，加入1.2g口服液或含糖颗粒冲剂基质，加0.6 ml 12 mol/L氢氧化钠溶液, 2g碳酸氢钠:碳酸钾(3:2 W/W)的固体缓冲剂2，混匀,调pH=10左右,用3mL 乙酸乙酯：异丙醇（9：1 V/V）3提取两次，合并后浓缩至干后，用4ml 5% 醋酸溶解，用1g固体缓冲剂1，调pH=10左右，用4 mL三氯甲烷反提，加入无水硫酸钠干燥，将有机层移至磨口锥形试管中，在650C氮气下吹干。2）茶和淀粉剂基质：取上述溶液1数份，分别加入0.2g上述基质，加入2g固体缓冲剂2，调pH=9.6左右，再加入3mL提取液3，振荡10分钟，离心5分钟。冷冻分层后弃去水相，将有机相转移至10mL离心管中。在650C氮气下吹干。3）补酒基质：取上述溶液1，加入0.9g补酒，在旋转蒸发仪上蒸去乙醇，再按样品提取1提取。4）蛋白粉基质：取上述溶液1，加至SEP-PAK C18小柱固体萃取，分别用5mL甲醇和水洗脱，洗脱液加100mg半胱氨酸，再加入0.5mL浓盐酸，在100C下水解30分钟，冷至室温。加3mL乙醚洗，弃去有机相，向水相中加入0.6mL 12 mol/L氢氧化钠，混匀。加入2g固体缓冲剂2，混匀。再加入3mL提取液3，振荡10分钟，离心5分钟。冷冻分层后弃去水相，将有机相转移至10mL离心管中,氮气流下吹干。5）油状基质：取上述溶液，加100mg半胱氨酸，再加入0.5mL浓盐酸，在100C下水解30分钟，冷至室温。加3mL乙醚洗，再用3mL正己烷洗，弃去有机相，向水相中加入0.6mL 12 mol/L氢氧化钠，混匀。加入2g固体缓冲剂2，再加入3mL提取液3，振荡10分钟，离心5分钟。冷冻分层后弃去水相，将有机相转移至10mL离心管中,氮气流下吹干。2.6 衍生化： 在残渣中加入MSTFA 100mL，振荡，在70C下反应10分钟。加入MBTFA 30mL，在70C下反应10分钟。转移至衍生化小瓶中，进2mL于GC/MSD。3 结果与讨论方法的回收率: 1）对照样品的制备：准确量取浓度为1 mg/ml的 PE、CA、 methadone、 MO、PT、CD、DH、 EM、AD各10g两份,吹干，各加入5mL空白尿，加入2g固体缓冲剂2，再加入3mL提取液3，振荡10分钟，离心5分钟。冷冻分层后弃去水相，将有机相转移至10mL离心管中。2）同时取5个两份空白尿按不同的5种方法提取后,有机相中分别加入0.5mL对照样品,吹干,衍生化(1,2); 3）在5份两个试管中分别加对照样品0.5mL, 氮气流下吹干。各加入5种不同基质的物质5mL，按不同的5种方法提取后, 吹干,衍生化。（编号为3，4-含糖、膏基质液；5，6-茶和淀粉剂基质；7，8-补酒基质；9，10-蛋白粉基质；11，12-蛋白粉基质）。用每个物质的特征离子为定性离子，用3、4的平均峰面积/1、2的平均峰面积，5、6平均峰面积/1、2的平均峰面积,5，6平均峰面积/1、2的平均峰面积,， 7、8平均峰面积/1、2的平均峰面积，9、10平均峰面积/1、2的平均峰面积，11、12平均峰面积/1、2的平均峰面积，结果见表1. 表1NameADCACDDHEMMEMOPEPTM/z172823713733857242928971Extra170.2 %82.6 %68.6 %69.1 %71.4 %91.6 %73.1 %89.6 %82.7 %Extra273.2 %84.3 %76.1 %76.5 %74.3 %89.6 %80.1 %86.7 %80.4 %Extra370.3 %80.7 %72.9 %73.8 %70.9 %80.6 %76.6 %78.6 %79.8 %Extra480.3 %86.7 %82 %78.9 %76.3 %88.4 %70.8 %72.6 %70.4 % Extra