12级DNA的生物合成1.ppt

第十章核酸的生物合成 DNA是生物遗传的主要物质基础 生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上 表现为特定的核苷酸排列顺序 并通过DNA的复制由亲代传递给子代 在后代的生长发育过程中 遗传信息自DNA转录给RNA 然后翻译成特异的蛋白质 以执行各种生命功能 使后代表现出与亲代相似的遗传性状 中心法则 1964 1970劳氏肉瘤病毒的遗传方式致癌RNA病毒 1958年 遗传信息的单向 复制 亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下 生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程 转录 以DNA为模板 按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA 形成一条与DNA链互补的RNA的过程 翻译 亦叫转译 以mRNA为模板 将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程 逆转录 以RNA为模板 在逆转录酶的作用下 生成DNA的过程 第一节DNA的生物合成 一 DNA的半保留复制 semiconservatiereplication Watson和Crick开创性的论文 对DNA双螺旋的描述以这样一段陈述结尾 不出我们的意料 我们所假设的特异性配对立即提示一种遗传物质可能的复制机制 复制时DNA的两条链分开 以每一条链作模板 用碱基配对方式按照单链DNA的 脱氧 核苷酸顺序合成新链 以组成新DNA分子 这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样 每个子代分子的一条链来自亲代DNA 另一条链是新合成的 这种复制方式即半保留复制 新链 旧链 DNA的半保留复制的生物学意义 DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性 保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代 但DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质 半保留复制 半保留复制的实验证据1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA 首先证明了DNA的半保留复制 亲代 第一代 第二代 二 复制的起点和方向 一 概念复制子 replicon 基因组能独立进行复制的单位成为复制子 起点 origin 控制复制起始 是含有100 200个碱基对的一段DNA 细胞内存在着能识别起点的特殊蛋白质 在大肠杆菌中称为DnaA蛋白 终点 terminus 终止复制复制叉 replicationfork 复制开始后由于DNA双链解开 在两股单链上进行复制 形成在显微镜下可看到的叉状结构 称为复制叉 原核生物 只有一个复制子真核生物 多个复制子 多个起点 形成多个 复制眼 或 复制泡 二 起始和方向1 原核生物和真核生物复制都是在DNA分子特定的位置起始的 如大肠杆菌起始点有固定的保守顺序GATC和TTATCCACA 多次出现 可被酶识别 2 方向 大多是双向对称 也有单向或不对称3 速度 原核生物复制叉移动速度快 约105bp min 真核生物复制叉移动速度慢 约5 102 5 103bp min 三 原核细胞DNA的复制 DNA指导下的DNA合成 一 DNA聚合酶1956年kornberg等首先从大肠杆菌中发现DNA聚合酶 其后在广泛不同的生物中都找到有这种酶 亲核攻击 5 3 底物 dNTP dATPdGTPdCTPdTTP 聚合酶 polymerase DNA pol 依赖DNA的DNA聚合酶 是1种模板指导的酶模板 template 解开成单链的DNA母链 引物 primer 提供3 OH末端 使dNTP聚合 其它酶和蛋白质因子 ArthurKornbergwonthe1959NobelPrizeinMedicineforhisdiscoveryofthemechanisminthebiologicalsynthesisofdeoxyribonucleicacid beforeWatsonandCrickwontheirs 1 大肠杆菌DNA聚合酶 polymerase pol 也称Kornberg酶 是各种DNA聚合酶中研究的最透彻的 它的一些特点代表了DNA聚合酶的基本特点 1 pol 的性质分子量 10 9000 单链 球形 活性部位含Zn2 电镜下可以看到二聚体 每个细胞有400个酶分子 2 功能 5 3 聚合酶活性 酶与模板结合后构象改变 识别碱基 正确配对后才发挥聚合作用 3 5 外切酶活性 主要是对新生DNA链进行校对 防止 错配 5 3 外切酶活性 主要是对DNA损伤的修复 以及在DNA复制时RNA引物的切除及其空隙的填补 2 大肠杆菌DNA聚合酶 pol 1 分子量 120000 单链 每个细胞100个酶分子 2 功能 5 3 聚合酶活性 3 5 外切酶活性 该酶无5 3 外切酶活性 且活性很低 功能尚不清楚 3 大肠杆菌DNA聚合酶 pol DNA复制酶 1972年发现 1 pol 是真正起复制作用的酶 由10种亚基组成不对称二聚体 组成核心酶 2 功能 5 3 聚合酶活性 3 5 外切酶活性 该酶在原核细胞中主要负责DNA链的延伸 是复制延长中真正起催化作用的酶 E coliDNA聚合酶 不对称二聚体 可滑动的夹持器亚基 催化亚基 3 5 外切酶亚基 前导链合成 后随链合成 夹持器装置 催化亚基 亚基保持核心酶的二聚体结构 亚基具有5 3 方向合成DNA的催化活性 亚基具有3 5 外切酶活性 起校对功能 可提高聚合酶 复制DNA的保真性 亚基可能起组建的作用 亚基犹如夹子 功能是识别引物 夹住DNA分子向前滑动 亚基起着促使核心酶二聚化的作用 其余的亚基构成 复合物 主要功能是帮助 亚基夹住DNA 也称夹子装置器 并有增强核心酶活性的作用 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 亚基数目1 单体酶 1 多亚基酶 1 多亚基酶 5 3 聚合活性 中 很低 很高3 5 外切活性 保护DNA复制的忠实性 5 3 外切活性 主要是对DNA损伤的修复 以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙 修复紫外光引起的DNA损伤 DNA复制的主要聚合酶 还具有3 5 外切酶的校对功能 提高DNA复制的保真性 1 冈崎片段和半不连续复制 1 冈崎片段 逆复制叉合成的小的DNA片段 在原核生物有1000 2000核苷酸 真核生物约100 200核苷酸 1968年冈崎 Okazaki 发现 2 DNA的半不连续复制 DNA双链复制时 一条链是连续合成的 前导链 另一条链是不连续合成的 滞后链或后随链 这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制称DNA的半不连续复制 二 双链DNA复制的分子机制 DNA的双向复制 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 2 DNA半不连续复制中的RNA引物 1 前导链和滞后链的合成都需要RNA引物 2 引物合成酶 DnaG 是以DNA为模板的RNA聚合酶 合成方向5 3 合成的引物长度5 10nt 3 引物RNA的起始和终止的位置受解链酶 引发酶 模板顺序及其二级结构的影响 4 DNA聚合酶 切除前导链及冈崎片段的引物后 填补空缺 由DNA连接酶将切口连接 RNA引物的合成称作 引发 后随链的合成需多次引发作用 而发动前导链的合成只需一次引发 3 DNA连接酶 ligase 催化两段DNA之间的连接 3 5 5 3 5 3 5 3 HO P DNAligase NAD ATP NMN AMP PPi DNA连接酶 1967年发现 若双链DNA中一条链有切口 而且一端是3 OH 另一端是5 磷酸基 连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键 而使切口连接 但是它不能将两个游离的DNA分子连接起来 大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶需要NAD 提供能量 在高等生物和噬菌体中 则要ATP提供能量 T4DNA连接酶可连接两个游离的DNA分子 4 母本DNA双链的分离 1 DNA解链酶 解螺旋酶 DnaB 通过水解ATP将DNA两条链打开 每解开一对碱基需要水解2个ATP分子 2 单链结合蛋白 single strandbindingprotein SSB 稳定已被解开的DNA单链 阻止复性和保护单链不被核酸酶降解 3 DNA旋转酶或称拓扑异构酶II 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使DNA两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力 当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量 同复制有关 除连环数 L 不同其他性质均相同的DNA分子称拓扑异构体 超螺旋周数W 扭曲数拓扑连环数L 一条以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数 缠绕数T 双螺旋的圈数B DNA模型螺旋数W L TW 0松弛环W为负值负超螺旋 右手扭曲 W为正正超螺旋 左手扭曲 总结 原核生物DNA的复制过程 以大肠杆菌为例 双链的解开起始 RNA引物的合成DNA链的延伸终止 切除RNA引物 填补缺口 连接相邻的DNA片段 B RNA引物的合成引发体先与DNA起始部位双链结合 通过引物合成酶形成前导链引物后 再沿5 3 模板链与复制叉同向移动 在移动中断断续续形成冈崎片段的RNA引物 A 双链的解开DNA旋转酶 拓扑异构酶 DNA解链酶 单链结合蛋白协同作用 C DNA链的延伸在DNA聚合酶 的催化下 以四种dNTP为底物 在RNA引物的3 端以磷酸二酯键连接上脱氧核苷酸并释放出焦磷酸 DNA链的延伸同时进行领头链和随后链的合成 前导链的延长 DNA聚合酶 全酶二聚体的一个亚基与前导链的模板结合而发挥催化作用 与复制叉同向 滞后链的延长DNA聚合酶 全酶二聚体的另一亚基与形成一个环的滞后链的模板结合发挥催化作用 由于模板形成环 即时酶向沿复制叉方向移动时 滞后链合成片段也能沿5 3 方向生长 与酶催化方向一致 滞后链片段合成接近前方滞后链片段5 末端时 模板被释放 环消失 继续重复 连续进行 D 复制终止 切除RNA引物 填补缺口 连接相邻的DNA片段当新形成的冈崎片段延长至一定长度 其3 OH遇到上一个冈崎片段时即停止合成 复制叉移动到终止区即停止复制 大肠杆菌有一个终止区 这时会发生一系列变化 1 在DNA聚合酶 催化下切除RNA引物 留下的空隙由该酶催化合成一段DNA填补上 2 在DNA连接酶作用下 连接相邻的DNA链 3 修复掺入DNA链的错配碱基 以修复方式填补终止区50 100bp的空缺 这样以两条亲代DNA链为模板 各自形成一条新的DNA互补链 结果形成了两个DNA双股螺旋分子 复制的保真性 fidelity 和碱基选择 依赖三种机制碱基配对 错配率10 2聚合酶对碱基的选择 错配率10 2校读功能 错配率10 2体外合成至少达到的水平 体内复制叉的复杂结构 修复系统对错配碱基的检查 DNA损伤修复 5 DNA聚合酶的 校对 作用 DNA复制的真实性DNA复制错配率10 9 10 10 大肠杆菌染色体中有4 5X106bp 每1000个细胞经过一次分裂才会插入一个不正确的碱基 维持DNA复制准确性的因素 内因 按碱基配对原则 DNA聚合酶的作用 对碱基的识别作用 选择正确的碱基参入到引物末端 对底物的识别作用 先识别引物最后一个碱基是否正确 后识别参入的dNTP是否正确 校正阅读3 5 外切酶的作用 RNA引物最终被切除 提高了复制的准确性 外因 四种dNTP要平衡 Mn2 和Mg2 的比例 浓度 酶活 真核生物的DNA聚合酶 5种DNA pol DNA pol 复制延长中催化作用 合成引物 DNA复制DNA pol 与DNA polI相似 校对 修复 填补DNA pol 线粒体内 线粒体合成DNA pol 在无其它DNA pol时起作用 修复 四 真核细胞DNA的复制 DNA指导下的DNA合成 在真核细胞内有五种DNA聚合酶 与细菌DNA聚合酶的性质基本相同 底物 模板 引物 方向 定位细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核3 5 外切 酶活性功能 引物合成 修复作用 线粒体DNA的复制 核DNA的复制 修复作用 真核生物中DNA的复制特点 1 真核生物染色体有多个复制起点 多复制眼 呈双向复制 多复制子 2 冈崎片段长约200bp 3 真核生物DNA复制速度比原核慢 4 真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制 而在快速生长的原核中 起点可以连续发动复制 真核生物快速生长时 往往采用更多的复制起点 5 真核生物有多种DNA聚合酶 6 真核生物线性染色体两端有端粒结构 防止染色体间的末端连接 由端粒酶负责新合成链5 RNA引物切除后的填补 亦保持端粒的一定长度 端粒酶是含RNA的逆转录酶 归纳 生物细胞DNA复制分子机制的基本特点P 254 端粒 telomere 是真核生物线性染色体的两个末端所具有的特殊结构 由许多成串短的重复序列组成 其共同特点是一条链上富含T G短序列的多次重复 而其互补链上富含A C 四膜虫端粒重复单位TTGGGG 人TTAGGG 端粒功能 稳定染色体末端结构 防止染色体间末端连接 补偿滞后链5 末端在消除RNA引物后造成的空缺 母链藉非标准碱基配对回折 DNA聚合酶 端粒合成完成 进一步加工 动物生殖细胞中存在端粒酶 端粒一直保持一定长度 体细胞随着分化而失去端粒酶活性 细胞连续分裂会使端粒不断缩短 短到一定程度引起细胞生长停止或凋亡 肿瘤细胞发现端粒酶活性 端粒酶可作为抗癌治疗的靶位点 五 DNA的损伤修复DNA的损伤 DNA在复制时产生错配 病毒基因整合 某些物化因子如紫外光 电离辐射和化学诱变等 破坏DNA的双螺旋结构 从而影响DNA的复制 并使DNA的转录和翻译也跟着变化 因而表现出异常的特征 生物突变 若DNA的损伤或错配得不到修复 会导致DNA突变 其主要形式 一个或几个碱基被置换插入一个或几个碱基一个或多个碱基对缺失DNA的损伤修复 四种修复途径 光复活修复 切除修复 复组修复和诱导修复 亦称暗修复 光复活修复 400nm左右的光激活光复活酶 专一分解紫外光照射引起的同一条链上TT CCCT 二聚体 包括从单细胞生物到鸟类 而高等哺乳动物无 切除修复 将DNA分子中的受损伤部分切除 以完整的那条链为模板再重新合成 特异内切酶 DNA聚合酶 DNA外切酶 DNA连接酶均参与 发生在DNA复制前 重组修复 发生在复制后 复制时 跳过损伤部位 新链产生缺口由母链弥补 原损伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释 诱导修复 造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应 称为应急反应 SOSresponse 此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白和酶 同时产生无校对功能的DNA聚合酶 所以会有2种结果 修复或变异 进化 重组修复 5 重组 修复 定义 以RNA为模板 按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA称为反转录 由逆转录酶催化进行 1970年Temin和Baltimore同时分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出反转录酶 迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆转录酶 六 反转录作用 RNA指导的DNA合成 病毒RNA的反转录过程 以前病毒形式引起整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化 单链病毒RNARNA DNA杂交分子双链DNA 前病毒 逆转录酶是多功能酶 兼有3种酶的活性 RNA指导的DNA聚合酶活性DNA指导的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H的活性 专一水解RNA DNA杂交分子中的RNA 可沿5 3 和3 5 两个方向起核酸外切酶的作用 反转录酶也和DNA聚合酶一样 沿5 3 方向合成DNA 并要求短链RNA DNA 作引物 cDNA 利用反转录酶可合成出与任何RNA模板 mRNA tRNA或rRNA 的碱基序列互补的DNA 互补DNA cDNA 几乎所有真核生物mRNA分子的3 末端都有一段polyA 当加入寡聚dT作为引物时 mRNA就可作为模板 在反转录酶催化下在体外合成与其互补的cDNA 为研究真核结构基因提供了有效途径 反转录酶发现的理论和实践意义 不能把 中心法则 绝对化 遗传信息也可以从RNA传递到DNA 促进了分子生物学 生物化学和病毒学的研究 为肿瘤的防治提供了新的线索 目前反转录酶已经成为研究这些学科的有力工具 七 细菌的限制 修饰系统 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶识别的序列具有二次旋转对称性 有回文结构 限制性核酸内切酶酶切产生平头末端或粘性末端 平头末端 Hpa 粘性