第15章 干细胞技术.doc

第15章 干细胞技术第1节 干细胞概述1、干细胞研究的发展1961年，Till 和 McCulloch：骨髓细胞注入小鼠体内，细胞在脾中形成集落。来自集落的细胞具有多向分化潜能和自我更新的能力。 01967年，托马斯：如果将正常人的骨髓移植到 病人体内，可以治疗造血功能障碍。1981年Evans和Kaufman：从小鼠囊胚中分离获得了小鼠的内细胞团并建立了胚胎干细胞系。1998年11月， Thomason等：成功分离了人的内细胞团并成功建立了人的胚胎干细胞系，使人类胚胎干细胞在体外生长和增殖。1999年，美国科学院院刊：小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞。 1999年12月，干细胞研究被科学杂志评选为该年度世界十大科学进展之首。2000年干细胞研究再度被科学杂志列入年度世界十大科学进展。2006年，Yamanaka 和Takahashi: 诱导性多潜能干细胞（iPS细胞）建立； 2007年，Thomson等和Yamanaka等：用人类皮肤细胞培养出iPS细胞。 2007年Evans等三位学者因在干细胞研究和基因敲除领域里做出的杰出贡献而荣获诺贝尔生理及医学奖。 2008年，（iPS细胞）的成功获得被Science杂志评选为年度世界十大科技进展之首；2010年iPS细胞的研究进展再次入选年度十大科学突破。 2009年，周琪等：用iPS细胞通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，证明iPS细胞具有与ES细胞相似的多潜能性。该成果被美国时代周刊评为2009年全球十大生物医学进展之一。 2、干细胞的定义和分类2.1 定义尚无统一说法，一般认为：干细胞是来自胚胎、胎儿或成体内具有在一定条件下无限自我更新和增殖能力以及不同程度分化潜能的一类细胞，在一定的条件下能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化细胞，还能分化为祖细胞。2 分类2.1根据来源：1）胚胎干细胞： 从胚胎内细胞团（ICM）或原始生殖细胞（PGC）经体外培养筛选出的细胞,还可以利用体细胞核转移技术（SCNT ）获得。2）成体干细胞（组织干细胞）： 存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并能特化形成组成该类型组织的细胞。3）诱导性多潜能干细胞（iPS细胞） 通过基因转染技术将某些转录因子导入动物或人的体细胞并进行重新编程得到的具有类似胚胎干细胞的高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞2.2 根据分化潜能分类全能干细胞：具有自我更新和分化形成任何类型细胞的能力，有形成完整个体的分化潜能。 亚全能干细胞（多潜能干细胞（pluripotent stem cell）、万能干细胞、三胚层多能干细胞等）：失去了发育成完整个体的能力，但仍具有形成内、中、外三个胚层来源的所有细胞类型潜能的干细胞多能干细胞（multipotent stem cell）：分化潜能较前两者差，只能分化出部分类型的细胞。专能干细胞（单能、偏能干细胞）：只能向单一方向分化，产生一种类型的细胞。 3 干细胞的生物学特点及其鉴别方法3.1 生物学特性干细胞是同时具有自我更新能力、分化能力和增殖能力的非特化细胞。干细胞的发育阶段越早，这三种能力也越强。干细胞的自我更新：干细胞分裂后子代干细胞能保持与自己相同的基因型与表型、维持未分化状态并具有相同的分化潜能。干细胞的分化：干细胞分裂后转变为形态上、机能上、化学构成上与自己相异的子代细胞。干细胞的增殖：通过细胞有丝分裂实现细胞数量的扩增。干细胞有两种分裂方式：对称分裂；不对称分裂，3.1.1 胚胎干细胞 具有在一定条件下在体外无限扩增并保持未分化状态的能力。形态学特征：与胚胎细胞相似高分化潜能 （1）形成畸胎瘤 （2）形成类胚体 （3）形成嵌合体与亚全能性相关的标志物碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AKP）转录因子Oct-4(octamer-binding transcription factor 4) 端粒酶（telomerase）阶段特异性胚胎细胞表面抗原（Stage-specific embryonic antigens, SSEA）3.1.2 成体干细胞 ASC除了具备多能或单能分化能力（但不具备分化的全能性）、增殖能力和自我更新能力三大基本要素外，细胞形态和生长特性、表面标志物、体内外定向分化能力等生物学特点都随成体干细胞种类的不同而有较大差别。成体干细胞的可塑性（plasticity）： 一种组织的成体干细胞能超越该特定组织，分化成其他组织的功能性细胞，甚至具有跨越胚层分化为其他类型细胞的多潜能性。（1）可塑性与细胞异质性（2）可塑性与细胞融合（3）可塑性与脱分化 （4）可塑性与横向分化 成体干细胞的可塑性是基因表达和微环境共同作用的结果。3.1.3诱导性多潜能干细胞 iPS细胞的生物学特征与ES细胞有很大的相似性：包括细胞形态、生长特性、标志物表达、形成畸胎瘤，基因表达谱、DNA甲基化方式、染色体状态、形成嵌合体动物等附图：世界上第一只iPS细胞四倍体补偿小鼠“小小”（Tiny）第2节 分离纯化细胞常用技术1 解离组织和细胞悬液的制备酶学方法机械解离法螯合剂处理等2 利用细胞体积和密度进行分离纯化 密度梯度离心技术3 选择性的细胞凝集4 基于不同黏附特性的细胞分离方法 差速黏附处理；葡聚糖凝胶分离等 5 利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法5.1免疫溶解法抗体/补体介导细胞溶解法 当补体存在时，用抗细胞某一表面标志的特异性抗体与异质性细胞一起孵育，可以使具有该特异性表面标志的细胞溶解。 5.2 流式细胞分选术（流式细胞仪细胞分选法）常用：荧光激活细胞分选术（FACS）。不同细胞具有不同的表面标志,可用抗该表面标志的特异性单克隆抗体或多克隆抗体检测。 5.3 平面黏附分离法（淘选技术）在固相表面进行亲和分离细胞的技术 5.4 免疫磁珠分选技术（免疫磁珠分离法）将抗体或抗原结合在磁珠上，磁珠上的抗体（或抗原）与特异性抗原（或抗体）结合后，形成抗原-抗体磁珠免疫复合物；这种复合物在磁力作用下，可使复合物与其他物质分离。第3节 胚胎干细胞的分离和培养1 胚胎干细胞的分离主要来源：胚泡内细胞团和生殖嵴中的原始生殖细胞品系和取材时间胚泡中分离内细胞团的方法：1）免疫学方法2）显微外科学方法3）组织培养法2 胚胎干细胞的培养2.1 分化抑制物：饲养层细胞；特殊细胞的条件培养液；分化抑制因子等2.2 体外培养ES细胞的方法： 饲养层培养法 无饲养层培养法2.3 人胚胎干细胞（hESC）的培养人ES细胞与小鼠ES细胞有许多不同之处人类ES细胞的具体培养方案各不相同3 胚胎干细胞系的鉴定目前尚无单一、简便的方法，需要综合判断。一般多从细胞形态、细胞表面标志、分化潜能等方面对其进行鉴定。4 胚胎干细胞的诱导分化1）改变细胞的培养条件 添加生长因子、化学诱导剂等诱导物； 将ES细胞与其他细胞一起进行培养； 接种于适当的底物上2）导入外源基因3）体内定向分化5 胚胎干细胞的应用前景 及存在问题5.1前景探讨胚胎发育的调控机制临床应用建立药物筛选和研究平台动物克隆及改良5.2 存在问题（1）维持ES细胞未分化状态的机制及其定向诱导分化的调控机制尚不清楚。（2）ES细胞应用于临床治疗存在安全性问题（3）ES细胞真正用于器官克隆与移植仍有待技术上的突破（4）面临着一系列的伦理、宗教和社会学问题第4节 成体干细胞的分离和培养1 间充质干细胞（mesenchymal stem cell ，MSC）MSC的基本标准：1）贴壁生长；2）具有以下表型特征：95%的细胞表达CD105、CD73和CD90等，而绝大多数不表达CD45、CD34、CD14 、CD11b、CD79a及CD19等，也不表达MHC II类分子，如HLA2DR抗原等；3）具有分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞等三类细胞的能力。1.1 间充质干细胞的分离和培养分离方法尚无统一方案 密度梯度离心法 贴壁培养法（全骨髓法） 流式细胞仪或免疫磁珠分选MSC培养液的配方不统一 骨髓来源的MSC的原代培养液包括血清和无血清培养基两种 MSC的生长特性具有一定的种属差异性。对取材的条件，培养的方法和条件，接种的密度等有比较严格的要求。1.2 间充质干细胞的体外诱导分化 MSC具有多向分化潜能，但是调节机制尚不清楚。 和ES细胞类似，诱导物的选择和MSC对诱导物的反应以及其所在的微环境是影响MSC体外定向诱导分化的主要因素。2 造血干细胞2.1 造血干细胞的分离纯化HSC来源：骨髓、脐带血和动员的外周血。2.1 造血干细胞的分离全血去除红细胞白细胞沉淀离心(Ficoll) MNC CD34+细胞新表面标志：AC133可能是更早期造血祖细胞和造血干细胞的特异性标志；造血干细胞存在于CD34+KDR+亚群，而造血祖细胞主要存在于CD34+KDR-亚群 表15-1 造血干细胞的分离纯化方法：方法原理常用技术物理学方法化学方法免疫学方法生物学方法干细胞体积小，浮力（密度）低对特定物质的粘附性表面标记特性干细胞处于G0期，对细胞周期特异性的细胞毒性药物不敏感；活体染料拒染；高表达醛脱氢酶（ALDH）活性密度梯度离心，逆流离心淘洗，速度离心沉淀塑料黏附，基质黏附，植物凝集素亲和荧光激活细胞分选（FACS）, 免疫吸附分离（淘选技术、免疫吸附柱层析和磁珠分离）细胞周期药物杀伤（如5-Fu和4-HC等）。罗丹明123或Hoechst33342染色，ALDH荧光底物染色，结合FACS分选2.2 造血干细胞/祖细胞的体外培养 1）基质支持的培养体系2) 无基质支持的培养体系 3) 添加基质细胞条件培养液培养2.3 造血干细胞/祖细胞的体外定向诱导分化 HSC具有多向分化潜能，可以通过细胞因子的不同组合，定向诱导其分化。 决定HSC分化、成熟过程的机制仍知之甚少，存在争议： 造血干/祖细胞分化的随机性模型（stochastic model） 造血干/祖细胞分化的指导性模型（instructive model）2.4 成体干细胞的应用前景和存在问题2.4.1 应用前景1) 临床治疗：难治性血液病；组织器官的损伤和功能衰竭等可避免同种异体移植的免疫排斥反应等2) 基因治疗载体：HSC和MSC都是基因治疗中理想的载体细胞3) 组织工程种子细胞来源 理想种子细胞的标准：来源广，数量充足；容易培养，粘附力大，增殖力强，可大量扩增；遗传背景稳定，具备特定的生物学功能；纯度高，具有特定功能的细胞占主导；免疫排斥反应极小或无；分子结构和功能与再生组织的正常细胞相似；临床上易得，供体损伤小，具有实用性; 植入体内能高质量地修复组织并能保持良好的远期效果等。 ES细胞和成体干细胞都可以作为组织工程的种子细胞。骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞较为理想，皮肤干细胞、胰腺干细胞、眼角膜缘干细胞等和其他一些已经分化的细胞也都可用作组织工程的种子细胞。2.4.2尚待解决的问题1）ASC增殖分化的理论及体内外诱导分化、信号调节的机制；ASC的生物学特性，如表面标记等，分离方法、培养等都有待进一步研究。2) 尚未在人体的所有部位分离出成体干细胞。如何控制其体外增殖条件、延长其增殖代数、而又能维持未分化状态等。3) 成体干细胞的可塑性机制等还不清楚；尚未证实ASC能否产生体内所有的细胞类型；ASC没有ESC的增殖能力强等。4) ASC临床应用的生物学安全性问题第5节 诱导性多潜能干细胞（iPS细胞）1 iPS细胞的建立和诱导分化 1）多能性相关因子的选择 2）iPS 细胞的筛选 3）iPS 细胞的鉴定附图：iPS细胞的建立（下）鉴定: 细胞表型、表面标志、生长特性、发育潜能和表观遗传学特征等.2 iPS技术的改进2.1 避免或减少使用致癌基因2.2 减少病毒在基因组DNA中的整合2.3 将已整合的外源基因从iPS细胞的基因组中清除2.4 用小分子化合物替代转录因子2.5 利用脂质体和质粒介导2.6 直接导入重编程因子的蛋白2.7 提高iPS细胞的制备效率和安全性: 选择合适的细胞供体等3 iPS细胞的应用前景和尚待解决的问题3.1 应用前景 1) 细胞核重编程机制的研究 2) 基础和临床医学研究 3）新