常用标本制备技术.doc

常用标本制备技术一、常用光镜标本制备技术1.切片标本的制备：常用的切片方法为石蜡切片，其制备程序如下：取材 从动物身体割取所需的新鲜组织一小块（厚度约0.5厘米）。手术愈快愈好，以防组织的死后变化。固定 把切取的小块组织，迅速投入预先配好的固定液如10%福尔马林、0.5%锇酸、包氏液、岑克氏液、卡氏等固定液中固定，使组织细胞的蛋白质变性，组织块硬化，以保存组织细胞原有的形态。冲洗（洗涤） 组织块自固定液取出后，须经流水冲洗或乙醇洗涤，使组织中含有的固定液全部除去，直至洗净为止。脱水 脱水的目的在于除去组织中的水分。因为组织中的水分和石蜡是不相溶的，为不使组织块在脱水时产生收缩，所以一定要经过各级浓度的脱水剂（如乙醇等）将水分脱净。透明 组织块脱水后，须经既可和乙醇相混，亦可作石蜡溶剂的透明剂（如二甲苯）透明，使组织中的乙醇被透明剂所替代，才能浸蜡包埋。浸蜡 浸蜡是将包埋剂（石蜡）透入整个组织的过程。石蜡透入组织需要一定的温度（石蜡熔点）。所以浸蜡都在恒温箱中进行。包埋 制备一定形状的容器（如纸盒等），倒入熔化的石蜡，迅速夹取浸透石蜡的组织块放入盒内，待表面石蜡凝固后立即将容器投入水中，使它凝固成蜡块。切片 组织块经上述处理后，不仅变硬，且有石蜡支撑，可用切片机将包埋组织的蜡块切成薄片，一般厚度是58微米。贴片 把由切片机切下的蜡条，分割成小段，分别排放于滴有蒸馏水的载玻片上，在展片台上微热，使皱褶的蜡片伸展平正。烘片 把贴有蜡片的载玻片置于45恒温箱中，烘烤34小时，使切片干燥。脱蜡与复水 组织切片的脱蜡等过程是在染色缸中进行的，因此须预先准备洁净的染色缸，并分别放入二甲苯、各级浓度的乙醇及染料溶液，按顺序贴好标签。染色前须先进行脱蜡和复水，即用二甲苯溶去切片上的石蜡后再经各级浓度乙醇（自高浓度到低浓度）下行到水的过程。因为没有经过复水处理的切片不能用水溶性染料染色，所以在染色前必须再度复水。脱蜡与复水的步骤如下：切片浸入二甲苯310分钟二甲苯+纯乙醇（1：1）纯乙醇95%乙醇80%乙醇70%乙醇50%乙醇（以上每级乙醇停留的时间约25分钟）蒸馏水2分钟。染色 切片染色以后可增加组织细胞结构的对比度。常用的生物染料是苏木素和伊红，简称H.E.染色。苏木素是一种碱性染料，经苏木素染色的结构呈蓝紫色（如细胞核）。组织中可被碱性染料着色的结构称嗜碱性。伊红是一种酸性染料，被伊红染色的结构呈红色或粉红色（如细胞质）。可被酸性染料着色的结构称嗜酸性。H.E.染色的程序如下：将已浸入水中的切片取出放入苏木素染液510分钟自来水洗2分钟0.5%盐酸水分色数秒种（在显微镜下检查核褪至浅红色，细胞质及结缔组织近无色）蒸馏水1分钟0.1%氨水（蓝化）1分钟自来水冲洗510分钟蒸馏水1分钟50%乙醇70%乙醇80%乙醇90%乙醇（以上每级乙醇停留的时间约25分钟）0.5%伊红（95%乙醇溶液）25分钟95%乙醇分色（在显微镜下检查核呈蓝紫色，细胞质及结缔组织呈粉红色）95%乙醇轻洗（洗净玻片上剩余的伊红染液）。脱水 已染色的组织切片，为了长久保存，又须再经各级浓度的乙醇脱水。即将上述已被染色的组织切片依次放入95%乙醇1分钟纯乙醇（I）1分钟纯乙醇（）25分钟。透明 透明的目的是除去组织切片中的乙醇，因组织中的乙醇不与树胶相溶，所以必须用透明剂除去乙醇后才能封藏。即将上述已脱水的组织切片依次放入二甲苯+纯乙醇（1：1）25分钟二甲苯（I）25分钟二甲苯（）25分钟。封固 在切片上滴加中性树胶，用盖玻片进行封固，保存备用。机体内有些结构成分，需经硝酸银处理（镀银或银染）时可使硝酸银还原，形成银的微粒附着在组织结构上，呈棕黑色，称这种性质为亲银性。有些组织结构本身不能使硝酸银还原，需加还原剂使硝酸银还原，称此为嗜银性。此外，为了显示某些特殊结构成分，还可应用各种特殊染色方法，如雷锁辛品红染色液显示弹性纤维等。在制作较硬组织（如骨组织等）或较大组织器官（如眼球）等切片，为了减轻因石蜡包埋所产生的收缩，可用火棉胶（celloidin）代替石蜡进行浸透包埋，再进行切片染色。为了较好地保存细胞内的酶活性，可选用冷冻切片。它是将组织在低温条件下快速冻结，直接切片，进行染色。2、涂片、铺片、磨片标本的制备：血液等液体材料，可直接在玻片上涂片，干燥后再进行固定和染色。疏松结缔组织和肠系膜等薄层组织，可在玻片上撕开展平，制成铺片，待干燥后进行固定和染色。骨和牙等坚硬组织除用酸（如稀硝酸等）脱钙后再按常规制成切片处，还可直接研磨成薄的磨片进行染色观察。二、大体解剖技术操作规程及其注意事项（一）大体解剖标本的收集与防腐固定处理 1、收集标本时，须登记死者的死亡原因、性别、年龄等，办妥自愿捐献手续、家属签字等手续，免留后患。若系无主尸体亦须在公安、保卫部门办妥有关手续。2、进行消毒处理，避免传染病蔓延。3、进行固定防腐注射，配制5%10%的甲醛溶液作颈总动脉与股动脉灌注，按照标本大小选择注射剂量。如注射溶液过浓，解剖时容易造成肌纤维及血管断裂，过淡时标本容易腐败。温度高时注射5%左右溶液，温度低时注射10%左右溶液。根据季节气温的不同在5%10%之间浮动。4、注射完后标本在注射台上保留一到两天，使其毛细血管中溶液渗均匀，再行放入3%5%的甲醛溶液中保存。5、每具标本注射后必须在尸池中浸泡六个月后，方可进行大体解剖，如解剖过早则不易保存。6、若收集标本须作铸型标本用，宜将标本即时放血，取材越新鲜越好。剩余部分作局部注射保存。若作关节韧带等标本，取材后马上将肌肉等及时剥离，以防腐败发臭。收集腐败标本后可作沙埋腐蚀后取骨架为标本。（二）大体标本解剖1、将收集保存六个月以上的标本捞出、冲洗后，放入尸体台即可进行解剖。2、解剖前必须将镊、钳、剪、刀等工具准备完好，方可动手操作。视其操作部位，必须熟悉所作部位解剖层次结构，用圆刀切开皮肤并剥离之，用尖刀或剪等修洁神经、血管、肌肉等结构。大体标本制作之关键在于熟悉层次结构和熟练的操作技巧。否则易切断或破坏相关结构，且制作的标本不美观。若作系解教学标本宜采取两侧分别以深、浅层制作。完成后放入本院配制之保存液中待用。（三）特殊标本制作1、铸型标本（1）根据所取材料，按需要处理。（2）配制好铸型剂并加不同染料（一般示红色动脉，示静脉蓝色，示胆道绿色，示神经黄色等）。（3）分别采取不同腐蚀法，腐蚀后冲洗，装瓶保存。2、包埋标本（1）取出所需材料修洁凉干（有条件可抽空包埋）。（2）按需要选择好包埋材料。（3）包埋造型。3、陈列标本制作（1）按要求进行标本取材。（2）修洁、涂色。（3）装瓶、保存（若标本上涂色彩，不宜保存在本院配方的保存液中，以防脱色，仍须保留在5%10%的甲醛溶液中）。三、人体骨骼标本双氧水法制作（一）目的利用局解后的废旧材料制作人体骨骼标本（二）材料经防腐固定的局解后尸体标本、工业用双氧水、汽油和带盖标本箱。（三）方法1、取材：取骨质无损的标本，整体的或局部的均可。 2、软组织处理：将大块软组织包括筋膜、肌肉、内脏、脑等除掉后，常温下浸入5%-10%的双 氧水中，利用双氧水放氧产生气泡的机械作用使软组织松动，15-30天后取出，用清水冲洗后将骨膜撕掉，但韧带、关节囊、软骨、肌腱、骨间膜等可按需修洁保留（如做散的骨标本，则可将这些软组织很容易地清除掉）。 3、脱脂：将上述材料凉干后入汽油中脱脂4个月。注意材料要干燥，容器要密封，中途更换1次汽油即可。 4、清洁和保存：将脱脂后的材料置通风处让汽油挥发，然后浸入1%的洗衣粉内将表面的油渍洗净，再用清水冲洗干净。之后，置阴凉干燥处风干（为防止肋骨缩水变形，可用木条或有机玻璃支撑固定，待干后拆掉），涂刷清漆两遍即可保存。（四）结果及评价制作出的骨骼标本洁净美观，结构完整，骨的连结自然真实，骨间膜、椎间盘、肋软骨、耻骨间盘、韧带、关节囊、关节软骨等牢固地与骨连结在一起，胸廓，骨盆，脊椎等完全保持了其本来形态。采用双氧水浸泡处理软组织，有以下优点：（1）双氧水放氧产生氧泡的物理作用使与骨结合紧密的软组织松动，与骨较易分离，而干燥后这些软组织与骨的结合又变得紧密牢固了。（2）经双氧水浸泡后骨标本脱脂效果很好。（3）低浓度的双氧水对骨质的腐蚀性小，在常温下进行，处理的时间容易控制。四、辣根过氧化物酶（HRP）法操作规程（一）实验目的探讨某一针灸穴位区传入神经元的节段性分布。（二）药品和试剂HRP：Sigma Type IV RZ：3.2硝普钠（广州化学试剂厂）联大茴香胺（北京化学试剂厂）过氧化氢（上海桃浦化工厂）（三）仪器设备与材料100ml量筒、分析天平、500ml量筒、1000ml烧杯、2000ml烧杯、家免饲养笼、50l微量注 射器、精密试纸、普通光学显微镜，等。四）实验对象本院动物室提供的家兔，体重200020g。（五）实验环境室温1825，相对湿度60%75%。（六）操作步骤1主要溶液的制备（1）20%HRP液20l、HRP粉末5mg加20l生理盐水即此液。（2）2%多聚甲醛加1.25%戊二醛0.1M磷酸缓冲液（PH7.4）。0.1M磷酸缓冲液的制备：液：NaH2PO4H2O 27.6g加蒸馏水稀释至1000ml。液：Na2HPO412H2O 71.6g加蒸馏水稀释至1000ml.取液190ml、液810ml混合后加蒸馏水稀释至2000ml即得0.1M磷酸缓冲液（PH7.4）。2%多聚甲醛0.1M磷酸缓冲液的制备:20g多聚甲醛加0.1M磷酸缓冲至1000ml即得此液。2%多聚甲醛1.25%戊二醛0.1M磷酸缓冲液的制备:25%戊二醛50ml溶液加2%多聚甲醛0.1M磷酸缓冲液至1000ml即得。（3）Tris液的配制取3.6ml冰醋酸加蒸馏水至300ml。取4.08g无水醋酸钠加蒸馏水至150ml。取上液279ml和上液126ml混合，即为Tris液。混合后用精密试纸测其PH为4.4则可用。（4）O-D法中有关溶液配制A液的配制 取0.1MTris液10ml、0.2%明明胶液50ml、硝普钠200mg加蒸馏水至100ml、联大茴香胺80mg加蒸馏水至40ml、1.5%H2O20.8ml混合即得A液。B液的配制 取0.1Mtris液10ml、0.2%明胶液50ml、硝普钠8g、蒸馏水140ml混合即得B液。C液的配制 取0.1Mtris液20ml、0.2%明胶液100ml、蒸馏水280ml混合即可得C液。2定穴及针入深度：根据针灸学1、兽医针灸手册2确定。3动物分组、麻醉及HRP引入方式：将实验用家兔随机分成5组，即穴区组神经干组、切断神经组、切断血管组和空白对照组。用2%戊巴比妥纳、接40mg/kg体重，进行腹腔麻醉。穴区组、切断神经组、切断血管组，均在家兔某一目标穴区直接注射20%HRP液20l，神经干组在家兔目标穴区下神经干内注射20%HRP液20l，空白对照组则在家兔目标穴区直接注射20l生理盐水。4动物灌注：注射后45天进行，开胸经左心室升主动脉插管，同时剪开右心耳灌注如下药液：（1）04柠檬酸钠速灌300ml。（2）04生理盐水速灌1000ml。（3）04 2%多聚甲醛1.25%戊二醛0.1M磷酸缓冲液1000ml。前300ml速灌。后700ml缓慢滴入。全过程约40分钟。（4）04 10%蔗糖0.1M磷酸缓冲液800ml。前300ml速灌。后500ml缓慢滴入。约30分钟。5取材：取出两侧相应节段（据大体解剖学而定）全部脊神经节，并放入10%蔗糖0.1M磷酸缓冲液内。置冰箱内过夜。6冰冻切片 厚4050微米，并收集于0.1M磷酸缓冲液中。7成色反应（O-D法，有关A液、B液、C液配制见上）（1）04蒸馏水冲洗切片三次。（2）放入A液30分钟（置冰箱）。（3）04蒸馏冲洗切片三次。（4）放入B液30分钟（置冰箱）。（5）04蒸馏水冲洗切片三次。（6）放入C液中（置冰箱）。8蛋白甘油贴片91%中性红复染，脱水透明，最后中性树胶封片，光镜下观察。（七）实验结果及评价（以“上巨虚”穴区为例）1未注射侧的情况：所有的实验动物在未注射侧的切片上，各脊神经节都未出现标记细胞。2五组实验动物在脊神经节出现标记细胞的情况（1）穴区组 在切片上，可见注射侧脊神经节L4S2节段中都出现了标记细胞，以L7S2节段的标记细胞为最多。占总数的83%，其次为L2、L5、L4节段。腰段以L7为最多，占总数的40%；骶段以S1为最多，占总数的26%。其它各节段都未出现标记细胞。（2）神经干组 在切片上，可见注射侧在脊神经节L1S3节段中出现了标记细胞。以L7S2节段的标记细胞为最多。占总数的68.2%，其次为L5、L4、L3、S3、L2、L1、腰段以L7为最多，占总数31.3%。段以S1为最多，占总数的21%。其它各节段都未出现标记细胞。（3）切断神经组、空白对照组 在切片上各脊神经节都未出现标记细胞。（4）切断血管组 在切片上可见注射侧脊神经节L4S2节段中都出现了标记细胞，以L7S2为最多。占总数的76.9%，其次是L6、L5、和L4。腰段以L7节段为最多。占总数的31.7%，骶段以S1节段为最多，占总数的2.4%。其它各节段都未出现标记细胞。3大、中、小三型标记细胞在脊神经节内出现的情况本实验用Leitz测微尺测定实验中所有出现细胞的大小，其穴区组、神经干组、切断血管组都能见到大、中、小三型标记细胞，且都以中、小型细胞为主，各占