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细胞生物学实验细胞骨架的观察姓名：邓燕玲学号：201011202912专业：生命科学生物科学实验时间：20121030指导老师：张伟同组同学：张丽华实验目的1. 了解细胞骨架的组成、结构和功能。2. 学习细胞骨架标记的原理和方法。3. 学习用鬼笔环肽标记微丝的方法步骤。4. 观察小鼠胚胎成纤维细胞和中国仓鼠卵巢细胞的细胞微丝骨架。5. 讨论细胞骨架在中学中教学的重点与难点。实验原理1. 细胞骨架一般是指真核细胞质内的蛋白质纤维网架系统。广义大的细胞骨架包括细胞膜骨架、细胞核骨架和细胞质骨架。直至1963年，科学家用戊二醛在室温下固定成功后，人们才广泛地观察到各类细胞骨架纤维的存在。细胞骨架包括微管、微丝和中间纤维。不同成分有不同的结构和功能。细胞骨架处于不断地动态平衡中，并且有极性。2. 微丝的标记方法可分为在固定细胞中标记和在活体中标记。本实验采用的是固定细胞标记，主要运用带荧光探针的抗体或鬼笔环肽标记，这需要对样品进行化学固定和膜的通透。3. 荧光探针是一种标记物，其中包含的荧光物质在从外界吸收能量后变成激发态，在回到基态时以电磁波的形式释放能量，从而产生荧光。荧光物质在受到长时间的照射后会淬灭。4. 鬼笔环肽（phalloidin）是一种剧毒生物碱，能结合F-actin，而不与G-actin结合，并且在结合后可以抑制微丝的解聚，破坏微丝聚合和解聚的动态平衡。鬼笔环肽对细胞有毒害作用，因此不利于活体细胞的研究。5. 荧光显微镜是用于观察和分析样品中产生的荧光物质的成分和定位的一种光学显微镜，荧光物质在受到激发光的激发下，会发出比激发光波长更长的光，从而在显微镜下观察。实验器材1.材料：小鼠胚胎成纤维细胞、 CHO中国仓鼠卵巢细胞2.试剂：PEM缓冲液（50 mM pipes,5 mM EGTA, 5 mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 ），0.5 % Triton X-100 （溶于PEM缓冲液），4%多聚甲醛（溶于PEM缓冲液），55nM Alex -phalloidin 3.器械：荧光显微镜实验步骤1. 将小培养皿中的培养液用移液枪吸掉，加入预热的1mlPEM清洗，注意不要打在盖玻片上，洗三次。2. 加入1ml37C预热的0.5 % Triton X-100，放置10min。3. 加入预热的1mlPEM清洗，洗三次。4. 加入预热的4%多聚甲醛1ml，放置15min。5. 加入预热的1mlPEM清洗，洗三次。6. 剪下一段与载玻片宽度一样的封口膜，将封口膜包在在玻片上，在玻片上的封口膜上加10mL的 55nM Alex phalloidin，将载玻片有细胞的一面朝下盖片，在暗盒中静置25min。7. 用37预热的PEM洗三次，将载玻片有细胞的一面朝上转移到一个新的载玻片中，在荧光显微镜下观察并拍照。 实验结果思考题1. PEM缓冲液的作用是什么？答：促进微管中肌动蛋白的聚合，抑制其解聚，使微管形态固定，便于观察。2. 1Triton X-100
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