SDS-PAGE蛋白凝胶电泳

SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 实验目的 学习SDS PAGE测定蛋白质分子量的原理掌握垂直板电泳的操作方法 运用SDS PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定 实验流程 配胶 样品制备 电泳 1 5 2h 染色 20min 脱色 30min 2h 分析 配分离胶 下胶 配浓缩胶 上胶 实验过程 1 装配装置 BG verMINI型迷你垂直电泳槽 北京百晶 2 凝胶配制 实验过程 Acr有神经毒性 实验过程 3 灌胶 凝胶配制过程要迅速 催化剂TEMED要在注胶前再加入 否则凝结无法注胶 注胶过程最好一次性完成 避免产生气泡 1cm 下胶高度 距齿下1cm A 平齐 排气泡加速聚合 凝固 梳需平稳插入 梳口处不得有气泡 梳底需水平 加入分离胶溶液pH8 8 制备分离胶 下胶 封水的目的是使分离胶上表面平直 并排除气泡 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面 分离胶pH8 8 制备浓缩胶 浓缩胶 样品处理 实验过程 4 上样 电泳 A 样品加热 上样 B 电泳 1 上胶恒压80V 8V cm 2 下胶恒压120V 12V cm 浓缩胶pH6 8 分离胶pH8 8 上样及电泳 开始电压恒定在80V 当进入分离胶后改为120V 溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时 停止电泳 Stakinggel Separatinggel 电流路径 负极 正极 内槽 外槽 凝胶 外槽 实验过程 5 染色 脱色 染色20分钟 B 脱色30分钟至2小时 考马斯亮兰R250 蛋白质的染色方法 氨基黑血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳考马斯亮兰R 250 G250G250测定蛋白含量银染敏感度最高 常应用于蛋白质双向电泳 聚合原理 n n n n n Acr有神经毒性 n决定了交联度与浓度一起决定孔径的大小 过硫酸铵是催化剂TEMED是加速剂 蛋白质是29 1核酸是19 1 实验原理 1 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动 这种现象称为电泳 电荷分子大小分子形状 实验原理 浓缩效应 Cl Gly Cl Gly Cl Gly PH6 8 Cl Cl Cl Cl Cl Cl Gly Gly 主要离子 氯离子 甘氨酸离子 pI5 97 蛋白质离子 Gly Gly Pr Pr Pr PH8 8 Pr为什么带负电 加样缓冲液 二硫键 盐键 疏水作用 氢键 巯基乙醇 断二硫键 SDS 断化学键带负电荷 甘油 SDS Pr 1 4 1 促沉 溴酚兰 Tris 实验原理 浓缩效应 Cl Cl Cl pH6 8 Cl Cl Cl Cl Cl Cl 主要离子 氯离子 甘氨酸离子 pI5 97 蛋白质离子 pH8 8 快慢离子的产生高的电压梯度Pr 运动加速 实验原理 浓缩效应 Cl Cl Cl pH6 8 Cl Cl Cl Cl Cl Cl 主要离子 氯离子 甘氨酸离子 pI5 97 蛋白质离子 pH8 8 5 10 快慢离子的产生高的电压梯度Pr 运动加速浓缩效应 实验原理 分子筛效应 pH6 8 主要离子 氯离子 甘氨酸离子 pI5 97 蛋白质离子 pH8 8 5 10 甘氨酸解离增加无快慢离子Pr 根据分子量运动分子筛效应 实验原理 分子筛效应 pH6 8 主要离子 氯离子 甘氨酸离子 pI5 97 蛋白质离子 pH8 8 5 10 甘氨酸解离增加无快慢离子Pr 根据分子量运动分子筛效应 实验原理 分子筛效应 pH6 8 pH8 8 5 10 lgMw 电泳迁移率 lgMw bx K PrMw在11 7 165Kd 实验原理 分子筛效应 pH6 8 pH8 8 5 10 迁移率 蛋白质移动的距离 脱色后的胶长 染色前胶长 指示剂移动的距离 实验原理 迁移率 蛋白质移动的距离 指示剂移动的距离 染色前 蛋白质的带在哪呢 L1 L2 L3 L4 Lx L1XL3 L2XL4 PageRulerPrestainedProteinLadderAprestainedSDS PAGEMWmarkerwithcontrastingcoloredreferencebandsat10and70kDa 注意事项 采用此法测蛋白质分子量时 必须完全打开二硫键 多亚基蛋白问题有些蛋白质不能用SDS PAGE测定分子量 如电荷异常或构象异常的蛋白质 带有较大辅基的蛋白质 某些糖蛋白 以及一些结构蛋白 如胶原蛋白等 思考题 在不连续体系SDS PAGE中 当分离胶加完后 需在其上加一层水 为什么 电极缓冲液中甘氨酸的作用 在不连续体系SDS PAGE中 分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP 试述其作用 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟 97 66 44 29 20 14 Marker Tanon 1600数码凝胶图像分析系统GIS1D图像分析软件 Ver 4 00 诱导前后蛋白表达差异 IPTG诱导表达His GFP融和蛋白 31 9kD 1为诱导前 2 6分别为诱导0 5 1 1 5 2 2 5hrs 电泳过程中的不正常现象 1 微笑 现象指示剂前沿呈现两边向上的曲线形 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致 多出现于较厚的凝胶中 处理办法 待其充分凝固再作后续实验 2皱眉现象由于垂直电泳槽的装置不合适引起的 特别是当明胶和玻璃板组成的 三明治底部有气泡 或靠近隔片的凝胶聚合不完全处理办法 可在两板间加入适量缓冲液 以排除气泡 3 拖尾 现象样品溶解不佳引起或分离胶浓度过大 解决办法 加样前离心选择合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液加增溶试剂降低凝胶浓度 4 纹理 现象样品中的不溶性颗粒引起的 解决办法 增加溶解度离心除去不溶性颗粒 5偏斜现象电极放置不平行或加样位置偏斜引起 6 2整块胶分离的条带太宽主要是未浓缩好的原因处理办法 适当增加浓缩胶的长度 保证浓缩胶贮液的pH正确 6 7 适当降低电压 6 1某一条泳道条带太宽加样量太多或者加样孔泄露引起 7 鬼带 鬼带 就是在跑大分子 构象复杂的蛋白质分子时 常会出现在泳道顶端 有时在浓缩胶中 的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀 主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性 致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合 聚合成大分子 其分子量要比目标条带大 有时不能进入分离胶 但它却与目标条带有相同的免疫学活性 WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用 处理办法 在加热煮沸后 再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇 以补充不足的还原剂 或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化 谢谢 附 蛋白质的提取与定量方法 蛋白质提取不同来源 不同的方法 提取原则 细胞的破碎合适的裂解液一般在冰上进行加入适当的蛋白酶抑制剂 哺乳类细胞的裂解液 RIPA 50mMTris HCl pH7 4 150mMNaCl 1 NP 40 乙基苯基聚乙二醇 常用非离子性去垢剂 0 1 SDS 蛋白酶抑制剂 定量方法 紫外吸收法BCA法Lowry法Bradford法 以双缩脲为基础的方法 1 BCA法bicinchoninicacid二奎啉甲酸法 以双缩脲为基础的方法 2 lowry法folin酚法磷钨酸和磷钼酸钨蓝 钼蓝BCA和Lowry法比双缩脲灵敏高100倍0 005 0 10mg ml Bradford法 考马斯亮蓝G25