生化与分子生(1)_64470.doc

2012年研究生班生化与分子复习题一名词解释1. domain：即结构域，是蛋白质的一类结构单元，它是介于二级结构和三级结构之间的一种结构层次，是由超二级结构形成的紧密、稳定，并且在蛋白分子构象上明显可区分的区域，是蛋白质辅基和酶底物分子结合的部位。2. proteome：蛋白质组，由一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。3. Genome Polymorphism：基因组多态性，指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因。5. 免疫共沉淀：用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术，常用于验证蛋白质的特异性结合。6. 蛋白质的双向凝胶电泳：第一基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二基于分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。8. 基因治疗：指将正常的基因整合到细胞基因组以校正和/或置换致病基因的一种治疗方法。选择题1.基因工程中使用最广泛的基因载体是A、 质粒 B、 噬菌体 C、 病毒 D、 穿梭质粒 2.细胞周期中，DNA合成是哪个阶段？ A、 G1期 B、 S 期 C、 G2期 D、M期3.下列哪一项不是细胞坏死的特征？A、核破碎溶解B、细胞器结构破坏C、细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻D、有炎症反应，释放内容物4.下列哪一项不属于物理致癌因素？A、电离辐射 B、紫外线辐射 C、重金属 D、矿物纤维5.下列哪个不是人类肿瘤中的常见癌基因？ A、PTEN B、Ras C、CDK4 D、Myc6.下列哪个不是人类肿瘤中的常见抑癌基因？A、Rb B、P53 C、MDM2 D、P167. 以下蛋白质分离方法 是根据蛋白质的带电荷性质。A电泳 B亲和层析 C离子交换色谱 D反相高效液相色谱8. 在人类基因组序列中 所占的比例最高A、intron DNA B、Repetitive DNA C、Other Intergenic DNA D、Exon DNA 9.下面是基因诊断的常用技术A、核酸分子杂交B、PCRC、gene chipD.DNA sequencing E、RFLP二 简述题2.人类基因组计划完成后发现人类基因组编码大约多少个基因？从基因组表达出蛋白质可能有哪些调控步骤？答：大约3.5万个基因。调控步骤有：染色体水平：.基因活化的拓扑异构.碱基修饰变化（如去甲基化）组蛋白变化，使DNA疏松，暴露。转录翻译水平：转录水平调控、转录后水平调控（DNA重排如：抗体分子、mRNA感染、剪接、编辑）、翻译水平调控、蛋白质后加工阶段（蛋白剪切、修饰、运输）。3. 简述蛋白质组学的基本技术和应用。答：蛋白质组学主要研究细胞内所有蛋白质在生命过程中的表达，蛋白质之间的相互作用、翻译后的各种修饰等。其技术包括：蛋白质分离和鉴定技术：a.双向凝胶电泳 b.质谱分析 c.TCAT技术d.蛋白质芯片e.2DE分离的蛋白质斑点染色技术；蛋白质相互作用组学技术：a.酵母双杂交技术b.噬菌体展示技术c.表面等离子共振技术。应用：蛋白质组学在医学中的应用：运用蛋白质组学研究手段, 通过比较正常和病理情况下细胞或组织中蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异, 可以发现与病理改变有关的蛋白质和疾病特异性蛋白质, 这些蛋白质既可为疾病发病机制提供线索, 也可作为疾病诊断的分子标记, 还可作为治疗和药物开发的靶标, 其中肿瘤是蛋白质组研究应用最为广泛的领域；蛋白质组学在药物学中的应用：由于各种疾病的发生和药物治疗靶点大多数是在蛋白质( 酶、受体及信号转导蛋白) 水平, 蛋白质组学在寻找有效的药物靶点及新药开发方面有广泛的应用。8.比较原核生物与真核生物基因转录和翻译过程中的不同点。答：基因转录区别：真核生物和原核生物在基因表达调控上的巨大差别是由两者基本生活方式不同所决定的。原核生物主要通过转录调控以开启或关闭某些基因来适应环境条件尤其是营养水平的变化。真核生物基因调控范围更加宽广，并能在特定时间和特定细胞中激活特定的基因从而实现预定的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官保持正常功能。翻译区别：主要区别来自mRNA的本质差异以及小亚基与mRNA起始密码子上游区结合的能力。原核细胞mRNA较不稳定且多是多顺反子，在IF3介导下与核糖体小亚基16SrRNA结合。真核细胞需要几种起始因子来帮助mRNA形成起始复合物。一旦结合则核糖体开始相下游搜索直到找到第一个密码子。9.乳糖操纵子结构及转录调控机制。答：（1）乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。（2）阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。（3）CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。（4）协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。11.真核基因转录后加工。答：真核生物所转录的RNA往往需要经过一系列的加工才能成为成熟的mRNA，加工过程包括：链的裂解、5和3端的切除和特殊结构的形成、碱基修饰以及拼接(splicing)等过程。真核生物mRNA前体的加工。hnRNA转变为mRNA的加工过程包括：5 端形成特殊的帽子结构，m7G5ppp5 Np-。在3 端切断并加上一个poly(A)的尾巴.。tRNA的加工。RNase通过tRNA剪接反应除去内含子。对某些tRNA通过核苷酸基转移酶加上末端CCA序列。进行特异碱基修饰。初始 rRNA加工。大肠杆菌中在单一的转录本内就含有7个rRNA基因的拷贝。初级转录物大约含有6500个核苷酸，编码23S和16S rRNA，同时还编码着几种tRNA和小的5 S rRNA。分子克隆和核酸测序表明，23 S rRNA大约含有2900核苷酸，而16S rRNA大约含有1600核苷酸。将初始转录物加工成23 S rRNA和16S rRNA需要特异的核酸酶（RNases）催化。12.什么是顺式作用元件与反式作用因子？增强子的概念、作用特点及作用模式。答：顺式作用元件：顺式作用元件顺式作用元件(cis-actingelement)存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列。顺式作用元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们的作用是参与基因表达的调控。顺式作用元件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。 反式作用因子：是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。有时也称转录因子。增强子：指真核细胞中能增强启动子转录作用的远方顺式作用元件。 作用特点：a.远距离作用 b.无基因特异性 c.没有方向性。 作用模式：扭曲（twisting）通过扭曲作用使DNA链发生构型变化，更适合于通用转录因子与RNA聚合酶结合, 并通过直接接触或通过辅活化子/中介子而影响通用转录因子和RNA聚合酶的组装。滑动（sliding）沿DNA滑动，直到接触另一个特异DNA序列结合的转录因子，发挥作用。成环（looping）利用DNA分子的柔曲性弯曲成环，使增强子区域与RNA聚合酶结合位点靠近，直接接触或通过辅活化子/中介子而发挥作用。14.简述SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理。答：聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(和交联剂N，N一亚甲基双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铰，N，N，N，N 四甲基乙二胺作用下，聚合交联向成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳,是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离蛋白质的一种方法。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。在蛋白质组研究中。需要在同样的条件下同时走多块胶，这对凝胶与凝胶之间的比较十分重要。16.简述细胞凋亡的概念及其形态学特征。答：细胞凋亡：是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡的过程，是机体的一种基本生理机制，并贯穿于机体整个生命活动过程。细胞凋亡的形态学特征：细胞凋亡在形态学上分为三个阶段。凋亡的起始：细胞明显皱缩，染色质凝集、边缘化。这阶段的形态学变化表现为细胞表面的特化结构如微绒毛的消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整，未失去选择透性；细胞质中，线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布。凋亡小体的形成：首先，核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。从外观上看，细胞表面产生了许多泡状或芽状突起。以后，逐渐分隔，形成单个的凋亡小体。凋亡小体被吞噬。凋亡小体逐渐为邻近的细胞所吞噬并消化，不影响周围的细胞，不引起炎症反应。三 论述1.请设计克隆某一目的基因的主要实验过程并说明涉及的关键技术原理及注意事项。答： 由于不同生物的基因组成和基因排列不同，制备目的基因就采用不同的途径和方法。分离目的基因的方法有：直接分离法、基因文库分离法、PCR法和化学合成法。1）如果该目的基因为已知基因，且序列已知，则通过数据库查到基因序列，根据已知序列设计引物，PCR获得全长，凝胶回收后，与载体连接、转化、挑单克隆培养提取质粒DNA，测序验证。2）如果该目的基因为新材料中的基因，且序列未知，则可通过数据库进行同源基因序列搜索，比对分析，根据同源性高的部分设计引物，PCR获得片段，测序得到部分序列，根据已知的部分序列设计GSP引物，利用RACE分别获得5及3端序列，测序拼接成全长序列，再根据1）步的步骤获得该目的基因。关键技术：引物设计，利用碱基互补原理，注意引物Tm值、GC%含量、发夹结构、引物二聚体、错配等。连接、转化，利用Taq酶反应加A的特性，与T载体可以互补，连接。转化，则是利用互补显色反应原理，对阳性克隆进行筛选。注意连接时目的片段与载体的摩尔比为5：1-10：1,一般16度过夜连接，转化时注意感受态的制作和热激时间50s左右。质粒DNA提取则利用碱裂解法原理抽提，注意提取时蛋白要去除充分，RNA要消化干净。RACE原理，根据mRNA反转录时加入接头，利用GSP引物和接头引物将目的片段扩增出来。注意引物设计要长，Tm值要高。3.论述抑癌基因的特点及其对肿瘤发生的影响。答：是一类抑制细胞过度生长、繁殖从而遏制肿瘤形成的负调节基因。它与调控生长的原癌基因协调表达以维持细胞正常生长、增殖和分化。如果其功能失活或出现基因缺失、突变等异常，将导致细胞无限制地生长和分裂, 形成肿瘤。具有以下特点：在细胞水平抑癌基因表现为隐性。在功能上抑癌基因对细胞生长起负调节作用。抑癌基因的隐性突变不影响遗传物质的正常传递,带有单一等位基因突变的抑癌基因能够被传给下一代,使这些个体具有相应疾病的易感性。抑癌基因的丢失或失活不仅丧失抑癌作用，也可能变成具有促癌作用的癌基因而导致肿瘤的发生。有以下几种方式：（1）等位基因缺失和基因突变： 在视网膜细胞瘤小细胞肺癌非小细胞肺癌膀胱癌乳腺癌软组织肉瘤肝癌等肿瘤中发现有高频率的Rb等位基因丢失和基因突变，突变形式可表现为点突变缺失突变 插入突变 移码突变；（2）DNA修饰水平改变：急性淋巴细胞白血病与急性非淋巴细胞白血病患者p53基因第一启动子甲基化率升高；Rb基因有磷酸化和非磷酸化两种形式，非磷酸化形式称活性型，能促进细胞分化，抑制细胞增殖。4.举例论述细胞凋亡的生理学和病理学意义。答：细胞凋亡普遍存在于生物界，既发生于生理状态下，也发生于病理状态下。由于细胞凋亡对胚胎发育及形态发生、组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用，并具有潜在的治疗意义，至今仍是生物医学研究的热点。细胞凋亡过多可引起疾病发生，如：爱滋病的发展过程中，CD4+T细胞数目的减少；移植排斥反应中，细胞毒性T细胞介导的细胞死亡；缺血及再灌注损伤，导致心肌细胞和神经细胞的凋亡增多；神经系统退化性疾病的重要原因是细胞凋亡的异常增加。神经细胞的凋亡参与老化及Alzheimer病的发生。Alzheimer氏病是一种常见的老年病，患者在临床上表现为进行性