猪TYR基因外显子1的克隆测序及序列分析.doc

猪TYR基因外显子1的克隆测序及序列分析白小青基金项目 重庆市中青年科技专家基金项目（合同号：6852）、国家“十五”攻关资助项目（2002BA514A-7-5）作者简介 白小青（1976），男，陕西泾阳人，硕士，实习研究员，主要从事生物技术与家畜育种研究。E-mail：,王金勇（重庆市养猪重点实验室，重庆市养猪科学研究院， 重庆 荣昌 402460）摘要本研究对荣昌猪和内江猪的TYR基因外显子1进行了克隆测序及序列分析，结果发现3个新的突变位点：319CT，537C的插入，551AG。部分突变序列已被GenBank收录，登录号为 :AY236997。将突变序列翻译成氨基酸序列后发现，319CT和551AG是同义突变。537C的插入是移码突变，其是否会对猪的毛色造成影响，还有待进一步研究。关键词 酪氨酸酶基因；序列分析Cloning , Sequencing and Sequence Analysis of exon1 of Tyrosinase Gene in PigBai Xiaoqing Wang Jinyong(Chongqing Swine Science Academy , Rongchang Chongqing , 402460,China) Abstract In the paper,The sequences of exon1 of tyrosinase gene were cloned and analysed in Rongchang pig and Neijiang pig. As a result, three new point mutations( 319CT，The insertion of 537C，551AG) were observed. Part mutated sequence was recepted by GenBank and the accessin number was AY236997. The DNA sequences were translated into amino acid sequences and the result showed the displace mutations (319CT and 551AG) beloned synonymous mutations and the insertion mutation was frame mutation. Wether the insertion mutation affect coat color or not ,which needed to be deeply studied.Key words tyrosinase gene ; sequence analysis引言猪的各种毛色表型是由黑色素在毛皮质和髓质中沉积的种类和数量的不同造成的。黑色素有2种：真黑色素和褐黑色素1。2种黑色素的形成均与酪氨酸的氧化有关，而酪氨酸酶是酪氨酸氧化过程中的关键酶2。酪氨酸酶是一种含铜的金属糖蛋白,其主要功能是在黑色素生物合成中催化三步反应：酪氨酸羟化成-3,4-二羟苯丙氨酸(多巴),多巴氧化成多巴醌,5，6-二羟基吲哚氧化成吲哚-5,6-醌 3-5。黑色素实质是多巴醌、吲哚-5,6醌、多巴色素的聚合物6。酪氨酸酶由白化位点的酪氨酸酶基因编码,后者发生功能性突变，可导致白化,这已在人7、牛8、猕猴9,10等物种上得到证明。而且，其序列变异与白化病、毛色、肤色的相关性研究已成为一个热点。在猪上，尽管有少量的研究报道11-13，但是相对其他物种研究滞后。本研究对荣昌猪和内江猪的TYR基因外显子1进行了克隆测序及序列分析，旨在寻找新的突变，为与该基因相关的研究奠定基础。1 材料与方法1.1 实验动物纯白荣昌猪2头，大黑头荣昌猪1头，采自重庆市养猪科学研究院猪场。内江猪1头，采自四川省内江市资中县陈家沟乡农户。1.2 猪耳组织DNA的提取常规酚仿抽提。1.3引物合成本研究以序列（GenBank:AF181962,AF181963）为参考，采用Giuffra 等（2000）设计的引物用于纯白荣昌猪和大黑头荣昌猪TYR基因外显子1的扩增。引物序列为：1F ：GCTGGAAAGAGAAGTGTG 1R： GCCTTGGACAGAATGATG。引物均由上海国际生物工程公司合成。1.4 PCR扩增1.4.1 PCR体系 DNA 模板1 L（100 ng），10 PCR Buffer 2.5L，25 mM Mgcl2 1.5 L, 200 M dNTP 2 L ,Primer 1,Primer 2各1 L(25 M),Taq DNA聚合酶0.3 L(5 U / L) ,加灭菌水至25 L。1.4.2 PCR条件95 预变性5 min, 然后30个循环：95 30s，60 30 s,72 1 min. 最后72 保温10 min。2 结果与分析2.1 PCR扩增结果利用材料与方法中所述的引物及条件，扩增基因组DNA，得到目的条带。如图1所示所示。图1 猪TYR基因外显子1的PCR扩增产物电泳图谱注：M：DNA maker; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10: PCR产物Fig.1 Electrophoresis patterns of PCR products for exon 1 of porcine TYR gene (Primer:1-1F,1-1R)Note: M：DNA maker; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10: PCR product2.2猪TYR基因exon1的克隆测序及序列分析结果将正反向所测的序列利用DNAMAN软件进行人工拼接，得到4个大小为727bp的序列。而后进行两两比较后发现：2头全白荣昌猪所测序列100%相同，内江猪序列与全白荣昌猪序列100%相同，大黑头荣昌猪样品的序列相对于洋眼荣昌猪样品的序列在第319和551碱基处分别发生CT、AG的突变。参考其他物种相应序列的阅读框，将所测序列翻译成氨基酸序列后，发现此两种突变未造成氨基酸的改变，属于同义突变。将所测的4个DNA序列经BLAST工具与GenBank序列比对，结果发现：所得的4个序列（727bp，包括引物在内）与GenBank序列（AF181962、AF181963 ）比较，在第537碱基处（GenBank序列：第539-540碱基间）均有C碱基的插入（全白荣昌猪序列已被GenBank收录，登录号为 :AY236997）。图2列出了全白荣昌猪所测序列与GenBank序列（AF181962、AF181963、AF255610）比对的结果。0：1 AGGGGTAGCTGGAAAGAGAAGTGTGTGGCTCAATTAACAAGCTCAAACAG1：4 *2：4 *A*3：0：51 ACCTTGTGAGAACTAGAGGAAGAATGCTCCTGGCTGCTTTGTACTGCCTG1：54 *2：54 *3：0：101 CTCTGGACTTTCCAGACTTCCGCCGGACACTTCCCTCGAGCCTGTGCCTC1：104 *2：104 *3：1 *0：151 CTCCAAGAACCTGATGGAGAAGGAATGCTGCCCACCCTGGGGAGGTGATG1：154 *2：154 *3：51 *0：201 GGAGTCCCTGTGGCCAGCTCTCAGGCAGGGGTTCCTGTCAGGACATCATT1：204 *2：204 *3：101 *0：251 CTGTCCAAGGCACCCCTGGGACCTCAGTTCCCCTTCACCGGGGTGGATGA1：254 *2：254 *3：151 *0：301 ACGGGAGTCTTGGCCCTCCGTCTTTTACAACAGGACCTGCCAGTGCTTTG1：304 *2：304 *T*3：201 *0：351 GCAACTTCATGGGATTTAACTGTGGAAGTTGTAAGTTTGGCTTTCAGGGA1：354 *2：354 *3：251 *0：401 CCCAACTGCACAGAGAGGCGACTTTTGGTCAGAAGAAACATCTTTGATTT1：404 *2：404 *3：301 *0：451 GAGTGTGCCAGAGAAGAACAAATTTCTTGCCTACCTCACTTTAGCGAAAC1：454 *2：454 *3：351 *0：501 ATACTACCAGCCCAGACTTCGTCATCCCCACAGGCACCTATGGCCAAATG1：504 *-*2：504 *-*C*3：401 *0：551 AATAATGGATCAACACCCATGTTTAGTGACATCAACATTTATGACCTCTT1：553 *2：553 *3：451 *0：601 TGTCTGGATGCATTATTACGTGTCTAGGGACACACTACTTGGGGGCTCTG1：603 *2：603 *A*3：501 *0：651 AAATCTGGAGAGACATTGATTTTGCTCATGAAGCACCAGGTTTCCTGCCT1：653 *2：653 *3：551 *0：701 TGGCATCGACTCTTCTTGCTGGTATTG1：2：3：601 *图2 洋眼荣昌猪TYR基因exon1序列与GenBank序列比对结果注：0：所测序列；1：AF161962；2：AF161963；3：AF255610Fig. 2 The compairing result of exon1 sequence in tyrosinase inYangyan Rongchang Pig with the sequences in GenBankNote: 0：the sequence detected；1：AF161962；2：AF161963；3：AF2556103 讨论与结论Giuffra等（2000）用PCR产物直接测序的方法，得到猪的酪氨酸酶基因外显子1的序列。研究中发现,酪氨酸酶基因有2个等位基因：TYR*1和TYR*2。二者的的差别在于4个同义突变：31G(A)、331C(T)、544T(C)、628T(A)。本实验采用Giuffra设计的引物，对2头纯白荣昌猪，1头大黑头荣昌猪，1头内江猪共计四个样品的TYR基因外显子1进行了克隆测序并与Giuffra所测序列进行了比对。结果发现，相对于Giuffra所测序列（AF181962），作者所测4个序列一致性有C的插入（GenBank序列：第539-540碱基间）。另外，大黑头荣昌猪样品的序列相对于洋眼荣昌猪样品的序列在第319和551碱基处分别发生CT、AG的突变。后两个突变是同义突变。插入突变造成移码，其是否会对猪的毛色造成影响，还有待进一步研究。参考文献1 Kazumatsu M L, Shosuke I.Interaction of Major Coat Color Functions in Mice as Studied by Chemical Analysis of Eumelanin and PheomelaninJ.Pigment Cell Research,2001,14:21-23.2 Ponnazhagan S, Hou L, Kwon BS. 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