★1生物胺的胶束毛细管电泳-化学发光实时检测.doc

Journal of Chromatography A, 1003 (2003) 211216生物胺的胶束毛细管电泳-化学发光实时检测刘彦明，程介克武汉大学化学学院，中国，武汉，430072收稿2003.3.25 接收2003.4.10摘要首次报道一种利用N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺标记生物胺(丙二胺，腐胺，尸胺和己二胺)的毛细管电泳-化学发光实时检测方法。研究了毛细管区带电泳和胶束毛细管电泳(MEKC)两种不同模式。结果显示MEKC更能达到极好的分离目的。已优化影响分离过程和化学发光检测的各个参数。在最适宜的条件下，四种生物胺在7.5 min内基线分离。丙二胺，腐胺，尸胺和己二胺的检出限(S/N = 3)分别为3.510-8、3.510-8、3.910-8和1.210-7。这种方法被用来分析湖水中的生物胺。2003年Elsevier B.V.保留所有权利。关键词：检测、电泳、化学发光检测、生物胺1.前言生物胺在不同的生物体中自然合成。它们是微生物新陈代谢和活动的产物1。我们可以在细胞液、环境标本和工业流水线找到生物胺并常常检测它们的水平。胺类物质来自生物活动的排泄物。在食品分析中，多胺类尤其是腐胺和尸胺是被广泛应用的因素。气相色谱分析2,3，薄层色谱分析4,5和高效液相色谱分析(HPLC)方法5-11经常用来检测生物胺，而且HPLC是应用最广泛的。毛细管电泳(CE)已经被证明是一种强大的分离技术。近来，CE已经被成功用于分离胺类物质。至今为止，很多种检测方法，如荧光分析1,12-18、紫外-可见分光光度法19-24和电导分析25,26，都已经应用到毛细管电泳的检测。化学发光(CL)检测是一种高灵敏度且造价低廉和构造简单的光学系统，被证明可应用于传统的毛细管电泳27-32和微芯片33,34。Dadoo等人已经实现利用毛细管电泳-化学发光检测N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)衍生的精氨酸和甘氨酸35。近期，Liu等人完成利用毛细管电泳-氯化三(2,2-联吡啶)钌()电化学发光检测苯海拉明的研究36。在这项研究中，我们报道了利用ABEI标记生物胺(例如：1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、1,5-戊二胺和1,6-己二胺)的胶束毛细管电泳-化学发光实时检测方法。已优化影响分离过程和化学发光检测的各个参数。这种方法被计划用来分析湖水中的生物胺。2.实验方法2.1.试剂和溶液ABEI和丙二胺(Fluka，瑞士布克斯)。N,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯(Aldrich，美国威斯康辛州密尔沃基市)。腐胺、尸胺、己二胺和十二烷基磺酸钠(SDS)(Sigma，美国密苏里州圣路易斯市)。30%过氧化氢溶液，无水四硼酸钠和铁氰化钾(上海化工厂，中国上海)。所有试剂均为分析纯或以上。所有实验用水经过Water PRO PS系统(Labconco，美国堪萨斯州堪萨斯市)处理。电泳缓冲体系为硼酸盐和SDS且先经过0.22 m微膜过滤。进样溶液ABEI和DSC分别溶解在甲醇和乙腈中。胺类用甲醇溶解并稀释到所需的浓度。2.2.仪器CE-CL仪器为实验室自制。030 kV毛细管电泳高压电源(北京大学，中国)。内径50 m外径375 m分离毛细管(永年光学光纤厂，中国河北)。把毛细管尾部5 cm的涂层灼烧掉并用氢氟酸腐蚀2.5 h使外径大约为200 m。(先用石蜡密封毛细管的尖端以防止内壁的腐蚀)。氢氟酸处理完后将分离毛细管插入内径530 m的反应毛细管。将这两个毛细管固定在四路树脂玻璃连通器。柱后试剂(铁氰化钾和氢氧化钠混合溶液)在一个内径320 m的毛细管内通过重力作用加入。试剂毛细管的排放孔也通向四路连通器。用树脂玻璃做的螺母和聚酰亚胺的金属箍来安装上文提到的四路连通器里的三个毛细管。接地的电极也被放到连通器里去完成毛细管电泳的通路。反应毛细管的出口比其它毛细管缩进2 cm，使溶液更快更方便地流出反应毛细管。烧尽反应毛细管1 cm的聚酰胺涂层以形成检测池。化学发光信号用型号为R298光电倍增管(PMT，滨松光子学株式会社，日本)来收集。为了彻底收集化学发光信号，检测池正好位于光电倍增管的前部。光电流信号被供给型号为HX-2信号放大器(中国科学院化学研究所，中国北京)。用一个型号为3066的图表记录器来记录(四川第四仪器厂，中国)。全部化学发光检测系统被固定在避光的盒子里以排除外来光线的影响。2.3步骤2.3.1ABEI衍生生物胺的过程ABEI衍生生物胺的过程根据Kawasaki等人描述的步骤6。首先将5 mmol/L的DSC溶液加入5 mmol/L的ABEI甲醇溶液。此混合溶液置于室温2 h。所需的生物胺被加到50 L的ABEI-DSC混合溶液中。旋转搅拌混合后置于室温2 h。必要时可将衍生的胺类溶液稀释于5 mmol/L硼酸盐缓冲溶液中(pH 8.5)。已研究ABEI-DSC溶液的摩尔浓度影响胺类的因素。ABEI-DSC溶液对胺类的最适摩尔浓度为10 mmol/L已被找出。新的毛细管的清洗顺序是2 mol/L NaOH-CH3OH，1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl，水30 min，再用运行缓冲溶液平衡30 min。运行缓冲液加入过氧化氢。当四路连通器和反应毛细管先充满柱后试剂时，分离毛细管再充满运行缓冲液。在每次运行结束后，分离毛细管必须用运行缓冲液处理35 min。进样高度差要达到10 cm。3.结果与讨论3.1.分离方法的选择仅仅利用毛细管区带电泳固有的特性分离丙二胺，腐胺，尸胺和己二胺看起来是很困难的。实验结果显示，四种胺类不可以用硼酸盐缓冲体系的毛细管区带电泳分离。添加SDS可以有效的改善分离度和峰形。添加SDS使MEKC可以更好的分离结构相似且复杂的溶质37。发现SDS最适宜的浓度为80 mmol/L。然而更高浓度的SDS会导致更长的迁移时间和更大的电流。四种胺的SDS浓度对迁移时间的影响如图1。图1 SDS浓度对迁移时间的影响。条件：电泳缓冲液：10 mmol/L四硼酸钠+100 mmol/L H2O2+80 mmol/L SDS(pH 9.3)；柱后CL试剂：3 mmol/L K3Fe(CN)6+0.8 mol/L NaOH；进样：流动进样15 s；分离高压：22 kV。3.2.MEKC的优化我们优化的电泳缓冲溶液pH值(在8.011.0的范围内)、分离电压、进样时间、分离度和化学发光强度。结果显示运行的电泳缓冲液显著影响电渗流、分离度和灵敏度。当pH8.5时，丙二胺和腐胺的分离度不符合要求，同时尸胺和己二胺的峰形也变宽。当pH到达11.0时，许多分析物分离不佳而且很难鉴别。最适的pH是9.3。分离电压不仅影响迁移时间还影响分离度的灵敏度。随着电压的升高，迁移时间降低而且理论塔板数升高。因此看起来高电压更适合分离。然而电压的进一步升高会被电渗流的升高所限制，还会伴随焦耳热的升高，从而导致分离效率降低。丙二胺和腐胺的峰当分离电压超过24 kV时会部分重叠。因此，22 kV被选为最优分离电压。化学发光强度随着进样时间增长而增大，然而更长的进样时间会导致不理想的分离度，尤其是丙二胺和腐胺。在进样高度差为10 cm和进样时间为15 s时会获得较好的信号强度和分离度。3.3.化学发光检测的优化在化学发光检测时我们检测到H2O2、K3Fe(CN)6和NaOH在柱后溶液中。H2O2在化学反应体系中作为氧化剂，在灵敏度上有很大的影响。发现化学发光强度会随着H2O2浓度的增加而增强。然而，化学发光的强度和理论塔板数达到最优时的H2O2浓度为100 mmol/L。故使用100 mmol/L浓度的H2O2来做进一步的研究。在这个工作中，ABEI和过氧化氢的反应可以被K3Fe(CN)6催化，发现K3Fe(CN)6的浓度显著影响化学发光强度。如图2中所示，最理想的发光强度所对应的K3Fe(CN)6浓度为3 mmol/L，而且灵敏度在这个浓度左右两边的发光强度都显著下降。在浓度2 mmol/L下，化学发光强度和K3Fe(CN)6浓度是成正比例的。K3Fe(CN)6浓度高一点时，K3Fe(CN)6的颜色变得更深导致化学发光强度的下降。因此，可以采用3 mmol/L K3Fe(CN)6。检测中发现在柱后溶液中的NaOH溶液浓度同样影响着灵敏度，因为化学发光反应是取决于pH的。从结果中可以看出NaOH的浓度明显影响了化学发光强度。找出NaOH的最适浓度为0.8 mmol/L。.图2 K3Fe(CN)6浓度电化学发光图。条件同图1。3.4.定量分析图3展示的是使用最优条件获得的标准四种直链二元胺化合物的电泳图。可在7.5 min内获得基线分离。而且，所获得的电泳的峰都是非常尖锐且匀称的。精确(RSD)的峰的高度、迁移时间、线性范围和检测限(DLs)都列在表1中。图3 毛细管电泳分离混合的ABEI衍生的胺类。条件：电泳缓冲液：10 mmol/L四硼酸钠+100 mmol/L H2O2+80 mmol/L SDS(pH 9.3)；柱后CL试剂：3 mmol/L K3Fe(CN)6+0.8 mol/L NaOH；峰：1 = 丙二胺，2 = 腐胺，3 = 尸胺，4 = 己二胺，5、6和7显示的是衍生试剂的峰(ABEI或ABEI-DSC)，已在空白中确定。每个标准试剂的浓度是2.010-6mol/L，除了丙二胺是6.010-6mol/L。表1 迁移时间、峰高、线性范围和检测限(DLs)的相对标准偏差(n=5)3.5.现实生活中的应用这种先进的方法被应用到测定湖水样本中的胺类。新鲜的样本可以直接用盐酸酸化到pH为5.0，然后通过0.22-m的微膜均匀过滤。样本用ABEI-DSC衍生。在测试发现样本中有少量的腐胺(2.98 mol)和尸胺(2.25 mol)(如图4所示)。这种现象被认为是鱼和虾的尸体腐败的结果。在图4中发现，在实际工作中峰8和峰9都是未知的。在湖水中，加入胺类的标准物测得回收率(丙二胺为94.2%，腐胺为106.8%，尸胺为95.2%，己二胺为92.8%)。图4 湖水的电泳图。条件和峰的鉴别同图3(8和9是未知峰)。4.总结第一时间报道了一种用MEKC分离四种直链二元胺的实时化学发光检测方法。通过SDS修饰的硼酸盐缓冲溶液获得极好的分离效果。这个工作证明毛细管电泳和化学发光检测为小的有机离子的高灵敏的检测提供了一个新的简单的方法。这个方法有望进一步应用于其他胺类、氨基酸和蛋白质等的检测。致谢这个工作由中国国家自然科学基金支持(No.20075017)。参考文献1I. 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