槟榔中槟榔碱的提取分离及其活性研究.doc

槟榔中槟榔碱的提取分离及其活性研究 、?:;印砣秽姒. .海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下.独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名:日期:力年占月日歹咕玖学位论文版权使用授权说明本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定,即:学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果,知识产权归属海南大学。保密论文在解密后遵守此规定。导?:眠撕?一:秒数日期:加厂/年彦月日 日期:加,/肆二月日、.本人已经认真阅读“高校学位论文全文数据库发布章程”,同意将本人的学位论文提交“高校学位论文全文数据库”中全文发布?并可按“章程”中规定享受相关权益。回塞途塞握銮丘澄卮旦坐生;旦生目三生苤查。:作:论日 文期 孙年 日 导日 师期 阳 太寻 亡名厉躲勿利加签 罗抽 议搽土葑厂摘 要为了研究槟榔中槟榔碱及其生理活性,本研究拟采用乙醇回流提取法、超声波提取法、超临界萃取法等三种提取方法提取槟榔中的槟榔碱,结合高效液相色谱法对槟榔碱进行定性定量,并初步探讨了槟榔碱的抑菌和抗氧化两方面的生理活性。具体工作如下:.槟榔中槟榔碱检测方法的建立建立了高效液相色谱法测定槟榔中槟榔碱含量的方法。贝定槟榔中槟.,色谱柱;榔碱含量的适宜条件为:流动相为甲醇:.%体积分数的磷酸:/;流速. /检测波长;柱温;迸样量 。采用外标面积归一法测得样品含量。经验证,该方法.有较高的精密度、准确度及可靠性。.槟榔中槟榔碱的乙醇回流提取工艺研究以海南槟榔鲜果为研究对象,采用加热回流提取法从槟榔中提取槟榔碱。以槟榔碱得率为考察指标,用高效液相色谱法测定其含量,在单因素试验的基础上,采用正交试验得出槟榔中槟榔碱的最佳提取工艺:乙醇体积分数%,料液比:/,提取温度,碱化。槟榔碱得率为.%。.槟榔中槟榔碱的超声波提取工艺研究以海南槟榔鲜果为研究对象,采用超声波法提取法提取了槟榔果中的槟榔碱。探讨从槟榔中提取槟榔碱的提取率及超声波提取法的最佳工艺。以槟榔碱得率为考察指标,用高效液相色谱法测定其含量,在单因素实验的基础上,采用正交试验得出槟榔中槟榔碱的最佳提取工艺为:乙醇体积分数%,料液比为:,提取温度,碱化值为。槟榔碱得率为.%。.响应面法优化超临界萃取槟榔碱工艺以海南槟榔鲜果为研究对象,采用微波预处理超临界流体萃取槟榔中的槟榔碱,以槟榔碱得率为考察指标,用高效液相色谱法测定其含量。通过单因素试验对影响槟榔碱得率的个影响因素萃取时间、携带剂用量、流量、萃取温度、萃取压力和微波功率进行考察,并对个主要影响因素萃取压力、萃取温度和微波功率利用响应面法分析,模拟得到二次多项式回归方程的预测模型。结果表明:微波预处理能明显提高槟榔碱得率,最佳工艺条件为:萃取压力、萃取温度、微波功率,在此条件下槟榔碱得率为.%,与理论值.%相差不显著。.槟榔中槟榔碱体外抑菌活性研究以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、炭疽芽孢杆菌、黑曲霉、青霉等种菌作为供试菌,通过抗菌实验探讨槟榔碱的体外抗菌作用。实验结果表明,三种方法提取的槟榔碱对变形杆菌、白色念珠菌、炭疽芽孢杆菌有很好的抑制作用,超声波提取物的最低抑菌浓度为./、乙醇回流提取物的最低抑菌浓度为./、超临界萃取物的最低抑菌浓度为./,对黑曲霉、青霉没有抑制作用。三种方法提取的槟榔碱抑菌活性大小:超临界萃取法乙醇回流提取法超声波提取法。创新点:首次采用响应面法优化得到槟榔中槟榔碱提取得率相对较高的提取工艺,并首次探讨了槟榔碱的体外抑菌活性,且其活性大小与槟榔碱含量正相关。本课题得到了国家科技支撑计划和海南大学科研基金;的经费支持?关键词:槟榔;槟榔碱;提取;抑菌 , ,毛, :. . ? : . ,;:.% . /:/; ; ; ; .此. . . ., : .圮:/;%/;. ;. .%. , :. :;%; . . .%., . 嬲, , ,., , ,. ,: ., .%,.%. , , ,.,坞, ,./,./, ./, . 、 . : ,.,. 乙;.:嗍;斛.目 录摘 要?。、.?:目 录?.绪论二.槟榔生物碱简介?.槟榔生物碱提取分离方法的研究进展.溶剂提取槟榔生物碱的研究进展.超声波辅助提取槟榔生物碱的研究进展.微波辅助提取槟榔生物碱的研究进展?.超临界流体萃取槟榔生物碱的研究进展?.、槟榔生物碱测定方法的研究进展?.?.滴定法测定槟榔生物碱研究进展?。.酸性染料比色法测定槟榔生物碱研究进展?.薄层色谱扫描法测定槟榔生物碱研究进展?.高效液相色谱法测定槟榔生物碱研究进展.毛细管电泳分析法测定槟榔生物碱研究进展.槟榔生物碱的生物学活性研究进展?。.驱虫灭螺.对神经系统的作用。.对消化系统的作用。.对心血管系统的作用?。.毒性与副作用?。.研究内容及目的意义.主要内容?.、.目的意义?.材料与方法?.材料与试剂?。.仪器与设备.供试菌种.实验方法?.槟榔中槟榔碱检测方法的建立.槟榔中槟榔碱提取工艺的优化?.槟榔碱提取物的进一步分离纯化?.槟榔中槟榔碱体外抑菌活性研究实验结果与分析.槟榔中槟榔碱检测方法的建立的结果与分析.色谱条件的选择.标准曲线的绘制.槟榔碱标准品和样品色谱图?.测定方法的考察结果与分析.小结。.乙醇回流提取工艺优化的结果与分析?.单因素试验.正交试验?.小结。.超声波提取工艺优化的结果与分析.单因素实验.最佳工艺条件的确定.小结.响应面法优化超临界萃取槟榔碱的结果与分析?.单因素实验?、.?。.响应面分析法优化工艺条件?.、结。.槟榔碱提取物的进一步分离纯化结果?.?“?.槟榔碱体外抑菌试验的结果与分析.槟榔碱样品液的配制?。.抑菌圈的测定?.最低抑菌浓度试验?.、结.结论与展望.结论?.槟榔中槟榔碱检测方法的建立.槟榔中槟榔碱的优化提取.槟榔碱提取物的抑菌试验.问题与展望.槟榔生物碱的提取分离方面?.药理保健功效方面?。参考文献个人简介.到【谢?。绪论.槟榔生物碱简介槟榔 厶是中国一种名贵的南药,位列中国著名五大南药槟榔、益智、砂仁、巴戟、沉香之首,广泛分布于亚洲热带和澳大利亚北部,其果实有很好的药用价值,是唯一一种含有生物碱的棕榈科植物川。槟榔 ,中含有多种对人体有益的活性成分,比如含有生物碱、酚类化合物、脂肪油、氨基酸、矿物质等多种活性成分。槟榔生物碱中主要为槟榔碱,其次为槟榔次碱、去甲基槟榔碱、去甲基槟榔次碱、异去甲基槟榔次碱、槟榔副碱及高槟榔碱等,均与鞣酸结合成盐的形式存在。此外,在药理方面,槟榔碱是槟榔中主要的药理保健活性成分,也是槟榔生物碱中含量最多的一种生物碱。.槟榔生物碱提取分离方法的研究进展.溶剂提取槟榔生物碱的研究进展“溶剂提取法是根据槟榔生物碱的溶解性,选择有利于槟榔生物碱溶出,而不利于其他成分溶出的溶剂进行提取,从而有利于槟榔生物碱从槟榔原料中溶出的提取方法。其提取效果通常受溶剂种类、提取温度、提取时间、值等多种因素的影响。张林丽等【采用了氨水乙醚混合液反复提取,再以氯仿萃取多次,并对生槟榔、几种不同的炮制槟榔中槟榔碱的含量进行了比较,结果表明:各炮制槟榔中槟榔碱含量与生槟榔比较均有显著差异。杜道林等【根据槟榔碱的溶解性,采用氨水与乙醚混合液对槟榔碱进行萃取,结果表明:该法提取比较完全,且简便、等【在弱碱性的试验条件下采用二氯甲稳定性好、提取速度快。烷提取槟榔生物碱,并采用气相质谱联用仪分析,检测结果表明:该法能提取得等【】采用稀磷酸提取,同时保证槟榔碱及槟榔次碱的稳到槟榔生物碱。定性,结果表明该法提取得率明显高于水蒸汽蒸馏法。陈潮燕采用乙醇渗漉法提取,能将槟榔碱及槟榔次碱提取较完全。张战峰等【采用渗漉法从槟榔中提取分离槟榔碱,分别用稀盐酸和乙醇两种提取溶剂作比较,实验结果表明:稀盐酸提取法提取得率明显高于高浓度乙醇提取法,且具有工艺简便、经济、得率高等优点。史载锋等【】采用加热回流的方法提取槟榔碱,浓缩碱化后加氯仿萃取槟榔碱,再通过滴加氢溴酸生成槟榔碱氢溴酸盐结晶将槟榔碱从总碱中分离出来,与硝酸银反应使槟榔碱氢溴酸盐脱溴,可以得到纯度较高的槟榔碱。等【报道采用酸水对槟榔粉末进行加热回流提取,能较好的提取槟榔碱。、.超声波辅助提取槟榔生物碱的研究进展超声波辅助提取法是利用超声波辐射产生的强烈空化作用、热效应、机械作用等多级效应增大物质分子运动频率和速度,增强溶剂穿透力,从而有利于植物中有效成分的转移,提高提取效率,同时可保持被提取物质的结构和生物活性不发生变化【。与传统溶剂提取法相比,超声提取具有操作简便、提取时间短、消耗溶剂低、得率高、条件温和等优点【,特别适合天然产物的功能性成分提取研究。陈浩桉等 】根据槟榔碱的理化性质,比较了水、乙醇、乙醚三种溶剂的提取效果,结果表明氨性乙醚超声提取得率高、产物相对较纯,是最佳的提取方法。徐丽华等【 】比较了三种提取方法的提取效果,实验结果表明氨性乙醚超声提取法简便、省时,为最适合的方法。徐洁【】采用氨性乙醚超声辅助提取,再用硫酸萃取乙醚提取液,可确保槟榔生物碱完全形成溶于水的生物碱盐,结果较好。.微波辅助提取槟榔生物碱的研究进展微波辅助提取法眦是指用合适的溶剂在微波反应器中从天然产物中提取各种有效功能成分的技术和方法。微波具有穿透力强、加热效率高、选择性好等优点引。与传统提取技术比较,微波提取技术更适用于热不稳定物质,且可以明显缩短提取时间、降低能耗、降低溶剂耗用量以及提高有效成分提取得率。影响微波提取效率一般包括提取溶剂、提取时间、提取温度、提取功率等因素【。方馥蕊等采用微波辅助提取法,可加快槟榔碱等有效成分溶出的速度,并结合薄层色谱仪检测槟榔碱,与溶剂提取法和超声波提取法比较结果表明:微波法的提取率远远超过溶剂法,而且溶剂法的提取时间过长不适合于生产。该法与超声法的提取率虽然相当,但超声法耗时更长,从节省的角度看还是微波提取法最佳。.超临界流体萃取槟榔生物碱的研究进展超临界流体是指气体在超临界状态下既具有与气体相当的高扩散系数和低黏度,又具有对物质良好的渗透性和溶解能力的双重特点【,超临界流体萃取技术是一项集提取、分离、浓缩为一体的新型分离技术,具有低能耗、无污染、操作简便、选择性强、不破坏物质活性等优点【,已经广泛应用于天然产物的提取团。张春江等【】采用超临界流体萃取槟榔中的槟榔碱,并通过三因素二次通用旋转组合设计实施试验对工艺参数进行了优化,结果表明该试验模型具有实际的意义,能真实反映超临界萃取中温度、压力和时间的影响,并且萃取温度对槟榔碱的萃取量的影响明显高于萃取时间和压力。韩志萍等【】采用超临界流体萃取槟榔中的槟榔碱,对影响槟榔碱提取率的五个主要因素进行了单因素试验,并采用紫外分光光度计法测定槟榔碱含量。结果表明各因素对实验结果均有显著影响。.槟榔生物碱测定方法的研究进展多.滴定法测定槟榔生物碱研究进展我国药典【记载槟榔碱含量测定采用滴定法:用氨性乙醚对粉碎的槟榔样品进行反复的提取,再在提取液中加入指示剂及硫酸滴定液,并用氢氧化钠滴定。该法在前期应用比较广泛,现在逐步为新的检测方法所代替。.酸性染料比色法测定槟榔生物碱研究进展酸性染料比色法是通过槟榔生物碱盐与酸性染料溴甲酚绿溶液在乙酸.乙酸钠缓冲液中形成离子对,用氯仿萃取后,再加入碱液使酸性染料游离出来的方法。李晨等【】采用酸性染料比色法测定促肠胃动力有效部位中槟榔碱的含量。结果表明该法操作简便、稳定性好,可为以后相似实验提供方法学借鉴。高敏【等采用柱色谱法提取分离槟榔中的槟榔碱,并用酸性染料比色法测定槟榔碱的含量。结果表明该测定方法操作简便,仪器要求低,精密度较好,准确度较高,可用于测定槟榔碱的含量。徐洁【采用酸性染料比色法测定槟榔中总生物碱的含量,结果表明该方法简便、灵敏、准确度高。.薄层色谱扫描法测定槟榔生物碱研究进展薄层色谱扫描法是用可见光或紫外线的单色光照射展开后的薄层色谱板,测定薄层色谱斑点的吸光度随展开距离的变化,从而获得曲线的薄层色谱扫描图。槟榔中槟榔碱含量薄层扫描测定方法建立较迟,于二十世纪九十年代才见报道。卢英翠【】等采用乙醚浸提,再用氯仿萃取,利用薄层扫描方法测定槟榔中槟榔碱的含量,测定结果该法在四小时内稳定性较好。林励【等建立了槟榔中槟榔碱含量测定的薄层扫描法,以氢溴酸槟榔碱为对照品,根据对照品与样品斑点的扫描面积值,按外标两点法计算含量,测定结果在四小时内稳定,该法精密度良好,回收率高。.高效液相色谱法测定槟榔生物碱研究进展高效液相色谱法是一种物理物理化学分离分析方法,根据槟榔生物碱的溶解性,可直接用液相色谱进行分离测定,一般以氢溴酸槟榔碱谱图为标准对照,测定槟榔碱的含量,这种方法专属性好、分离效能高。涂佳等【】采用反相高效液相色谱法测定肝脏中的槟榔碱含量。结果表明该法灵敏度较好、精密度较高、重复性较好,可以用来测定槟榔碱的含量。陈浩桉等【采用高效阳离子交换色谱法测定槟榔中槟榔碱的含量,结果表明该法灵敏等【通过高效液相色谱法检测到新鲜度高、专一性好、分离效能高。槟榔中槟榔碱、槟榔次碱、去甲基槟榔碱、去甲基槟榔次碱等四种主要生物碱的含量。 等】采用反相高效液相色谱法测定槟榔嚼食者唾液中槟榔碱的含量,结果表明该法灵敏、精确。杨春等采用反相高效液相色谱法测定槟榔碱的含量,研究结果表明该法操作简便,具有良好的专一性、准确度和稳定性。等【】采用反相离子对高效液相色谱法同时测得了槟榔果中槟榔碱和槟榔次碱的含量。金德磊等【采用高效阳离子交换色谱法测定槟榔碱的含量。结果表明该法操作简便、专属性和准确度良好,可用于检测产品的质量。、.毛细管电泳分析法测定槟榔生物碱研究进展毛细管电泳分析法是一种根据各溶质组分的迁移率不同而进行分离的分析方法,该法分离效率高、分离速度快、样品用量少,是经典电泳技术和现代微柱分离结合的一种新技术。袁炜等【采用毛细管电泳分析方法测定槟榔中槟榔碱和槟榔次碱的含量,结果表明该法能用于槟榔碱和槟榔次碱的含量测定,并能使槟榔碱与槟榔次碱得到较好的分离,而且分析快速、分离效率高、进样量少、分析便利准确。.槟榔生物碱的生物学活性研究进展.驱虫灭螺大量研究表明,槟榔碱能够麻痹虫体神经系统,对虫体有较强的致瘫痪或杀伤作用,是槟榔中有效的驱虫成分。等报道在含/浓度槟榔碱的酪蛋白酵母膏琼脂培养基中,可导致丽蝇蛆%的死亡率。槟榔碱也能杀灭钉螺,而且与灭钉螺药物联用可明显增强灭钉螺作用,利用槟榔碱的灭钉螺协同作用,可显著降低化学灭螺药的投药量从而减少了对环境的污染【。谭苹等】运用扫描电镜和透射电镜观察槟榔碱单用及与杀螺药合用对钉螺形态结构的影响,发现槟榔碱与杀螺药合用能增强对钉螺软体结构和神经节细胞的.善破坏作用。何昌浩等【】采用世界卫生组织公布的“灭螺剂实验室终筛法”中的浸泡法,发现槟榔碱与灭螺药合用后,明显增强了灭螺效果。在探讨槟榔碱降低钉螺附壁上爬,增强灭螺效果的作用机制方面,张爱华等【研究表明较低浓度 的槟榔碱可增加钉螺足跖平滑肌的收缩活动,并推测这可能与槟榔碱直接开放钙通道,促使钙离子内流有关。姚伟星等研究表明不同浓度的槟榔碱对大鼠门。、静脉收缩力和心室肌钙通道电流作用都呈双相关性,推测槟榔碱降低钉螺上爬附壁率从而增强灭螺效果的作用可能与阻钙作用有关。邓静萍等【钉研究发现槟榔碱可使钉螺足平滑肌收缩力增加,且其促收缩活动可被维拉帕米所拮抗,从而推测槟榔碱可能具有阻钙作用,该研究从理论上解释了槟榔碱降低钉螺附壁上爬从而增强灭螺效果的作用机制。.对神经系统的作用嚼食槟榔可以增强记忆功能在民间是家喻户晓的事,而起主要作用的便是槟榔生物碱。给大鼠饲喂槟榔碱,大鼠脑部的乙酰胆碱浓度上升,而乙酰胆碱会作用于大脑皮质,使意识清醒,这可能是嚼食槟榔能够提神的原因【。刘玲等【研究表明槟榔碱水溶液有明显的缩瞳作用。研究表明【槟榔碱还可以兴奋胆碱受体,表现为兴奋骨骼肌和神经节。槟榔碱还可以通过激活下丘脑一垂体等【肾上腺皮质轴而增加内源性促肾上腺皮质激素释放激素的释放。、.研究表明:槟榔次碱虽缺少槟榔碱具有的典型拟副交感神经作用,但亦能影响小鼠的行为,可以降低小鼠的自主活动和探究行为。等【研究表明:临床注射适量的槟榔碱能改善老年痴呆症病人的认知能力和记忆力。 等哆通过建立实验动物模型证实作为一种类胆碱功能的槟榔碱对老龄鼠的时间知等【】发现槟榔碱觉损伤有削弱作用,能够改善老年性痴呆症。等【研究表明槟可通过激活非选择性型毒蕈碱受体而发挥兴奋作用。榔中的生物碱可用于治疗精神分裂症及精神抑郁症。另有研究表明【】槟榔中四种主要的生物碱,可以通过激活型非选择性毒蕈碱受体而产生止痛的效果。、.对消化系统的作用研究表吲】槟榔可用于治疗胃病、十二指肠溃疡等症。杜志敏等【发现槟榔碱可作为.受体兴奋药,能显著促进豚鼠离体回肠的自发性收缩,并且呈剂量依赖性关系,迸一步的剂量试验再次证实槟榔碱能显著促进小鼠胃肠运动。陈潮燕发现槟榔碱可能对胃肠道平滑肌活动有兴奋作用,可增大离体的豚鼠回肠自发性收缩的幅度,并且使收缩节律更整齐。倪依东等【研究发现槟榔碱对离体的大鼠胃底肌条、结肠及家兔十二指肠、回肠的收缩运动均有明显的增强作用,主要表现为张力的增加和振幅的变化。 等【】研究发现槟榔碱可以通过类胆碱功能受体的激活作用剂量,依赖性地抑制大鼠离体肾上腺体中儿茶酚、胺的释放。.对心血管系统的作用山丽梅等】研究发现槟榔碱能抑制血液及血管组织中重要的动脉粥样硬化相关因子的表达,可以激活血管内皮细胞乙酰胆碱激靶标,从而防止心脑血管疾病。陈冬梅等【“发现槟榔碱可剂量依赖性地对抗血栓形成,具有抗血栓的作用。韩容等发现槟榔碱能增强小鼠吗啡诱导的急性高活动性和吗啡行为敏化的形成。此外,适量的槟榔碱可以缓和血管紧张,还可降低血糖【】。.毒性与副作用,很多学者指出槟榔中的生物碱是槟榔具有毒性的主要原因,但同时都忽略了槟榔嚼食行为对口腔增加的负担以及槟榔果本身粗糙的纤维对于口腔所带来的强烈机械刺激在癌症发病过程中的作用。国际癌病研究学会早在年曾公开表示,槟榔内成分可能会造成口腔上皮细胞遗传物质异常,诱发口腔癌,但槟榔碱对于口腔细胞的毒性作用目前仍不完全清楚。.研究内容及目的意义.主要内容.槟榔中槟榔碱检测方法的建立采用高效液相色谱法对槟榔中槟榔碱进行定性和定量分析,通过对色谱条件的优化,再进行方法学考察,以氢溴酸槟榔碱为标准品,绘制标准曲线,建立可行的槟榔碱检测方法。.槟榔中槟榔碱的提取分离工艺研究多分别采用乙醇回流提取法、超声波提取法、超临界萃取法等三种提取方法提取槟榔中的槟榔碱,并优化出最佳提取工艺,比较得出得率最高且适合于产业化的提取工艺。提取完毕后对槟榔碱提取物进行粗分离,并采用柱层析法进。一步分离,得到纯度较高的槟榔碱。.槟榔中槟榔碱体外抑菌活性研究以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、炭疽芽孢杆菌、黑曲霉、青霉等种菌作为供试菌,对乙醇回流提取法、超声波提取法、超临界萃取法等三种提取方法获得的槟榔碱进行体外抑菌试验,比较抑菌效果。.目的意义目前,我国大部分槟榔不是走向药材市场,而是用于加工成人们的嗜好品,用于咀嚼,槟榔的临床药理价值及保健功效没有得到充分的利用。研究发现槟榔的药理保健作用是由槟榔碱来体现的,本研究着重研究槟榔碱的提取分离及其生理活性,这些研究对减少或消除槟榔的负面效应以及提高其正面效应具有重要的意义,也为槟榔加工副产物的综合利用和高附加值产品的开发提供了新的思路。材料与方法.材料与试剂槟榔鲜果采自海南大学儋州校区热带植物园内,为海南品种,以及牛肉膏、蛋白胨、琼脂、葡萄糖等。名称 纯度级别 生产厂家磷酸 分析纯 广州化学试剂厂无水乙醇 分析纯 广州化学试剂厂氯仿分析纯 广州化学试剂厂氨水 分析纯广州化学试剂厂氢溴酸分析纯 广州化学试剂厂无水硫酸钠分析纯 广州化学试剂厂盐酸分析纯 广州化学试剂厂氯化钠 分析纯 广州化学试剂厂氢氧化钠 分析纯广州化学试剂厂碘化铋钾分析纯 广州化学试剂厂硅胶目 化学纯 青鸟海洋化工厂色谱分析用水 超纯水自制甲醇色谱纯 美国天地公司 、氢溴酸槟榔碱对照品 纯度.% 德国. 公司纯度% 购自海口金厚特种气体有限公司点样用毛细管一 华西医药大学仪器厂.仪器与设备名称 型号生产厂家紫外可见分光光度计 日本岛津公司高效液相色谱仪 美国安捷伦公司溶剂过滤器 .天津津腾实验设备有限公司、循环水式真空泵 .巩义市英峪予华仪器厂超声波清洗机. 宁波海曙五方超声设备有限公司分析型研磨机 德国公司真空干燥箱上海一恒科技有限公司.电热鼓风干燥箱 重庆实验设备厂. 金坛市医疗仪器厂数显恒温水浴锅之. 上海亚荣生化仪器厂旋转蒸发器超临界萃取装置 德阳四创科技有限公司佛山市顺德区格兰仕微波炉电器微波炉. 有限公司智能生化培养箱 希斯百瑞仪器有限公司一致微厦门仪器有限公司自动高压蒸汽灭菌器. 梅特勒.托利多仪器上海有限公司电子分析天平.供试菌种大肠杆菌 、变、金黄色葡萄球菌形杆菌 、枯草芽孢杆菌 、白色念珠菌、炭疽芽孢杆菌、黑曲霉 、青霉。以上菌种均由海南大学食品学院提供。、.实验方法.槟榔中槟榔碱检测方法的建立目前,文献报道槟榔生物碱的含量测定方法主要有滴定法、极谱法、比色法、薄层扫描法法、高效液相色谱法法、气相色谱法法、液相色谱/质谱联用法/法、毛细管电泳分析法法等【引。由于/法、法、极谱法测定需要的仪器复杂,法需要对待测组分衍生化才能检测,在使用上都受到一定的限制。法常常因为板和显色反应的不同造成较大的误差,精密度较低,现已很少应用于定量分析。比色法只能测定槟榔中总生物碱的含量,不能测得槟榔中各种生物碱的含量。滴定法操作繁琐且准确度较低,现在已逐渐被其他方法代替。法适用于测定一种或几种槟榔生物碱。所以,本研究采用高效液相色谱法法对槟榔中槟榔碱进行定性和定量。通过对槟榔碱含量测定方法的考察,以建立槟榔中槟榔碱的检测方法。.色谱条件的优化方案.在色谱柱:,的条件下,通过对设定的波段范围、流动相、流速、迸样量、柱温等色谱条件的试验范围进行优化,得出最适宜的取值。.槟榔碱标准液的配制准确称量槟榔碱标准品.,加甲醇色谱纯定容至,再吸取定容至,即得到质量浓度为。/的槟榔碱标准品溶液,再从该标准液中分别吸取、,用甲醇定容至,即配制成质量浓度分别为./,./,./,./的系列浓度标准液。.测定方法的评价测定方法的精密度:精密移取为./浓度的氢溴酸槟榔碱标准品溶液,用针头过滤器过滤,滤过后置于进样瓶中,进样 ,测定峰面积,重复进样次,计算精密度。测定方法的稳定性:精密移取为./浓度的氢溴酸槟榔碱标准品溶液,用针头过滤器过滤,滤过后置于进样瓶中,进样 ,分别于、 依次进样,测定峰面积。加样回收率:将样品准确测定后,加入已知量的槟榔碱进行测定,然后用差减法求出回收率。.槟榔中槟榔碱提取工艺的优化.原料预处理取新鲜槟榔壳和槟榔籽烘干至质量恒定,粉碎过筛,即为槟榔壳和槟榔籽原料。.乙醇回流提取工艺优化方案试验工艺流程称取槟榔原料.,根据实验设计要求的工艺条件,设定料液比、乙醇浓度、提取时间、提取温度,进行乙醇回流提取。并采用化学分离法对提取物进行分离如流程图.。乙醇回收乙醇?浓缩槟榔总碱粗提物上稀盐酸萃取酸水层土氨水碱化氯回收氯叫浓缩槟榔碱粗提物、.乙醇溶解后氢溴酸化氢溴酸槟榔碱乙醇溶液真空干燥后甲醇溶解氢溴酸槟榔碱甲醇溶液上溶剂过滤器过滤法检测槟榔碱含量图.乙醇回流提取工艺流程图.单因素实验设计通过对设定的槟榔粉碎粒度、提取溶剂浓度、料液比、提取次数、碱化值、提取时间、提取温度等单因素的试验范围进行优化,得出单因素中合适的取值,作为选定正交试验范围的依据。正交试验设计根据单因素试验结果,选择合适的彳、曰、四个因素,各取水平,设计正交试验因素水平表如表.:爱.乙醇回流提取的因素水平表.:?。?。?一因素水?一?二.?一一墨. 坌?一兰.?三?.?.?丝毛.?.?墅二?.?.?一.鱼.超声波提取工艺的优化方案试验工艺流程乙醇回收乙醇?叫.浓缩槟榔总碱粗提物上稀盐酸萃取酸水层上氨水碱化回收氯槟榔碱粗提物乙醇溶解后氢溴酸化氢溴酸槟榔碱乙醇溶液真空干燥后甲醇溶解氢溴酸槟榔碱甲醇溶液上溶剂过滤器过滤法检测槟榔碱含量图.超声波提取工艺流程图叠.?一称取槟榔原料.,根据实验设计要求的工艺条件,设定料液比、乙醇浓度、提取时间、提取温度,在超声波频率为、超声功率为条件下进行超声波提取。并采用化学分离法对提取物进行分离如流程图.。单因素实验设计通过对设定的提取溶剂浓度、料液比、提取次数、碱化值、提取时间、提取温度等单因素的试验范围进行优化,得出单因素中合适的取值,作为选定正交试验范围的依据。正交试验设计根据单因素试验结果,选择合适的彳、曰、四个因素,各取水平,设计正交试验因素水平表如表.:表.超声波提取的因素水平表.超临界流体萃取工艺的优化方案试验工艺流程称取.槟榔原料,加适量的氨水碱化后,装入萃取罐中,设定分离器压力、温度,分离器压力、温度。再根据实验设计要求的工艺条件,设定萃取温度、压力、时间、流量、携带剂用量,进行超临界流体萃取。并采用化学分离法对提取物进行分离如流程图.。单因素实验设计通过对设定的萃取时间、携带剂用量、流量、萃取温度、萃取压力、微波预处理等单因素的试验范围进行优化,得出单因素中合适的取值,作为选定响应面试验范围的依据。萃产超临界院体萃取法上分姆 纱器回收氯仿一浓缩槟榔碱粗提物上乙醇溶解后氢溴酸化氢溴酸槟榔碱乙醇溶液上真空干燥后甲醇溶解氢溴酸槟榔碱甲醇溶液上溶剂过滤器过滤法检测槟榔碱含量图.超临界流体萃取工艺流程图. 、响应面分析法优化方案在单因素实验结果的基础上,根据.的中心组合实验设计原理,选取对槟榔碱得率影响较大的,三个主要因素进行研究。各因子编码值见表.,试验设计方案见表.。表.槟榔碱提取响应面分析因素与水平. ,.一一垫.一.表.槟榔碱提取响应面试验设计方案. 一?一编号堕竺堕墨丝丝 墨?一一毋.也岛.以岛彳彳 局一岛彳,彳 一岛一岛、 么西也.也历彳岛.也 岛彳岛彳 岛岛也彳岛一. 定量分析按照.项建立的检测方法对槟榔碱进行定性定量。.数据统计及槟榔碱得率的计算使用软件对数据进行分析处理,每组试验均重复次,实验数据表示为平均值标准偏差。槟榔碱提取得率/%/式中:坍一高效液相色谱法测定并计算得到的提取物中槟榔碱质量/:.原料质量/。.槟榔碱提取物的进一步分离纯化采用硅胶柱层析法【】对乙醇回流提取法、超声波提取法、超临界萃取法等三种提取方法所得的槟榔碱提取物进行分离纯化。.装柱取一根硅胶柱.,加入选定的淋洗剂至柱容积的四分之一,在柱底先用玻璃毛塞紧,再铺一层约五毫米厚的石英砂。将硅胶目,用前活化五小时装入烧杯中,加淋洗剂浸润,溶胀并调成糊状。打开柱下活塞调节流速为每秒钟一滴,将调好的硅胶在搅拌下自柱顶缓缓注入柱中,同时不断敲打柱子,使硅胶均匀、致密填充在柱内。全部吸附剂加完后,在吸附剂沉积面上盖一层约五毫米厚的石英砂,用氯仿平衡两小时。在整个装柱过程及装完柱后,都需始终确保吸附剂上面有一段液柱,否则柱内容易出现裂痕或气泡,从而影响分离效果。.加样取一定量槟榔碱样品,用硅胶适量,加入一定量的氯仿按一定比例浸泡过夜充分搅拌混匀,脱溶,使其成干燥粉末状,待硅胶内气泡被清除后再加入柱、中,在样品上面放少许棉花,以防止洗脱液冲散样品。.淋柱样品用甲醇.氯仿梯度洗脱,洗脱剂洗脱顺序按甲醇氯仿、的配比进行,使洗脱液的流速控制在每分钟.滴【。每收集一管,进行分段收集。.薄层检测氯仿.甲醇.氨水:.为展开剂,改良碘化铋钾试剂为显色剂,合并与标准品值相同的收集液。收集液旋转蒸发到一定量后将其真空干燥、.至质量恒定,即得槟榔碱纯化物。.槟榔中槟榔碱体外抑菌活性研究本研究拟采用乙醇回流提取法、超声波提取法、超临界萃取法等三种提取方法获得槟榔碱样品液,对槟榔碱的抑菌活性进行初步的研究。.培养基的制作咖牛肉膏蛋白胨培养基:称取蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠,溶解予蒸馏水中,用溶液调节至.,加入琼脂,加热溶解,分装,高压灭菌,供细菌培养使用。马铃薯一蔗糖琼脂培养基:称取马铃薯,去皮切块,加蒸馏水,煮沸 ,用四层纱布过滤,补加蒸馏水至,加入葡萄糖、琼脂,加热溶解,分装,高压灭菌,供真菌培养使用。质量分数为.%的生理盐水:称取.氯化钠,溶解于蒸馏水中,以每管、分装于试管中,高压灭菌。.菌悬液的制备将供试菌种分别转接到相应的固体斜面培养基上进行菌种斜面活化后。取少量已活化的待测菌于装有生理茵水的试管中,充分混合,制成菌悬液;再用无菌吸管吸取.上述菌悬液于另一支装有.生理盐水的试管中,进行稀释;细菌采用麦氏比浊法进行计数,调节浓度至含菌数每毫升个的菌悬液,真菌则采用显微镜直接记数法测菌体或孢子个数,调节至浓度为含孢子或菌体 /的菌悬液,备用。.抑菌圈的测定采用打孔法【】测定槟榔碱的抑菌活性,以抑菌圈大小作为槟榔碱抑菌活性的指标。将配制好的固体培养基融化后倒成约厚的平板,待凝固后取.菌悬液于培养基上,用无菌棉签涂布均匀,用无菌打孔器.在每一平板上等间距打四个孔,挑出孔内琼脂,用酒精灯火焰稍微封底,在其中的三个孔内加入配制好的提取液,另一个孔加入无水乙醇作为空白对照,要保证抑菌液不溢出。然后将各平板于相应温度下培养一定时间细菌于下培养:霉菌于下培养】。记录下抑菌圈的大小:采用十字交叉法测量抑菌圈的直径,取其平均值作为试验结果。抑茵圈直径抑菌直径.最低抑菌浓度试验将三种方法提取所得的槟榔碱配制成一定浓度的槟榔碱原液,再用二倍稀释法将槟榔碱原液稀释成不稀释、/、/、/等不同稀释度的样品液。在各无菌培养皿内分别加入 不同浓度的提取液。然后每皿倒入 已溶化的固体培养基稀释倍,混匀,.待培养基凝固后,每皿加入.菌悬液涂匀,每种浓度的槟榔碱样品液做个平行试验。并作无水乙醇空白、菌种空白、培养基空白每种空白做个平对照培养方法同上,观察结果。以完全不长菌的最低稀释浓度为槟榔碱的最低抑菌浓度,若含提取物的培养基肉眼不易辨明菌体的生长,可从各皿中取一环转接于固体平板上,培养 后观察有无菌落。.定量分析按照.项建立的检测方法对槟榔碱进行定性定量。.数据统计使用软件对数据进行分析处理,每组试验均重复次,实验数据表示为平均值标准偏差。实验结果与分析.槟榔中槟榔碱检测方法的建立的结果与分析.色谱条件的选择.检测波长的选择通过对槟榔碱甲醇溶液进行.波段范围扫描,发现其在波长处具有最大吸收峰见图.,这是由于槟榔碱的紫外末端吸收造成的,所以,本实验选用作为检测波长。光扫蚺甲厂/ 日 丫?、图.槟榔碱对照品的紫外吸收曲线.流动相的选择考虑到等度洗脱的应用更广泛,流动相的组分及其对峰形有较大影响,适当的酸度对峰型有一定的改善作用,本实验尝试了种流动相。试验结果见表.,经比较后本实验采用流动相甲醇:.%磷酸:进行洗脱。表.流动相试验结果、. .流动相的流速对分离效果的影响分别选用.、.、.、.、./的流速进行实验,结果见表.。可见流动相流速的变化对分离效果影响不大,但对保留时间有显著的影响。综合考虑,选择流速为./。表.流速的选择结果. ?一?一峰形麴兰递鎏巴塑翌 堡鱼时间 峰面积比例觞:?一.峰前延/宽胖.轻微峰前延.对称.分离效果差 .分离效果差.:主?二.二一二二:?一.进样量的选择分别选用.、.、此的进样量进行实验,结果见表.。可见进样量对峰形影响较大。综合考虑,选择进样量为.为最佳。、表.进样量的选择.?一鲎登量些生 堕丝?。?二?二?二竺”?堕亘墼些型坐曼旦一.对称、尖锐.很对称、尖锐.高胖.壹壁:坌塞墼墨至堑墨:兰丝二?竖一.柱温的选择柱温对实验结果的影响见表.,可知温度对实验影响不大,从节省角度及低温对活性物质有利等方面考虑,选择柱温为进行实验。表.柱温的选择. ?.墅旦垦坐型些坚丝壁迢羔绝曼. .基本对称.对称.很对称.很对称.对称.对称.对称.对称.对称墅整? ?一.垒箜一.标准曲线的绘制在优化好的色谱条件下,将配制好的标准液系列浓度依次进样,再根据实验的结果,以槟榔碱质量浓删横坐标,峰面积为纵坐标,得标准曲线见图.,其线性回归方程:.,相关系数:.,在.咖浓度范围内,线性良好?图.槟榔碱标准曲线.槟榔碱标准品和样品色谱图在优化好的色谱条件下,分别进样标准品和样品溶液,得其槟榔碱标准品色谱图.及槟榔碱样品图.。图.槟榔碱标准品的肿图谱.图.槟榔碱样品的窿谱.测定方法的考察结果与分析.精密度试验精密度实验结果如表.所示。.%,表明该方法具有较高的精密度。表.精密度实验结果. ?一箜亘墼垩塑堕亘墼塑型楚壅堡羞垦璺垒丝?型塞盗墼一. .? 一.稳定性试验稳定性实验结果如表.所示。.%,表明该溶液在 内稳定。表.稳定性实验. .回收率试验回收率实验结果如表.,结果平均回收率为,.%,表明该法的回收率符合测定要求。表.回收率实验. 相对标准偏差编 样品中槟榔 加入槟榔碱标 测得总 回收率 平均回收垦墨里丝量 熊量翌曼 壅曼量翌墨 量堡 丝 空塾乞 . 卯.吼 弧竹盼 毁站.乞. 屯& 眩%舛. 支 加.小结通过对法测定槟榔碱方法的考察,得到适宜的条件为:色谱柱:.,流动相为甲醇.%体积分数的磷酸,流速. /,检测波长,柱温,进样量,线性范围./。该法具有较好的精密度、准确度及稳定性。可有效地用于槟榔中槟榔碱的测定。.乙醇回流提取工艺优化的结果与分析.单因素试验.槟榔粉碎粒度的选择选择提取时间为,提取溶剂为 %的乙醇溶液,提取温度为,碱化,测定槟榔碱得率,对槟榔果不同部位和不同粉碎度进行试验。其结一、果见图.。.毋芝卜需.赡醺篷箧.嚣 鼙辎蝤.目目目目槟榔提取原料的选择乙醇浓度/%图.槟榔果的不同部位对槟榔碱得率的影响 图.乙醇体积分数对槟榔碱得率的影响 . 从图.可以看出,槟榔壳的槟榔碱得率要高于槟榔籽,而且原料粉碎粒度在过目筛范围内,随着粉碎粒度的减小槟榔碱得率逐渐增大,而在过目筛后槟榔碱得率反而降低。原因可能是粉碎粒度太细导致原料表面张力增大,不利于有效成分的溶出。故原料粉碎粒度选择过目筛为宜。.提取溶剂浓度的选择槟榔碱及其盐都能溶于甲醇和乙醇。甲醇的沸点比乙醇低,极性比乙醇大,对生物碱盐类的溶解性能也比乙醇好,但它对视神经的毒性很大,所以多数用乙醇作为提取溶剂。称取研碎的槟榔壳粉末.,按料液比:/分别加入体积分数%、%、%、%、%、%的乙醇溶液,在水浴中回流提取,提取完后残渣再如上法提取次,碱化,测定槟榔碱得率,结果见图.。从图.可以看出,槟榔碱的得率在%体积分数范围内呈上升趋势,%时达到最大,至体积分数为%时得率反而减小,但下降幅度不大,原因是高体积分数的乙醇把其他脂溶性杂质成分提取出来,影响了槟榔碱的溶出。故可选择乙醇体积分数%为最佳。.料液比对槟榔碱