甘草多糖的提取及纯化.doc

甘草表面红棕色或灰棕色，具显著的纵皱纹、沟纹、皮孔及稀疏的细根痕。质坚实，断面略显纤维性，黄白色，粉性，形成层环明显，射线放射状，有的有裂隙。根茎呈圆柱形，表面有芽痕，断面中部有髓。栽培要点：喜阳光充沛，日照长，气温低的干燥气候。宜选土层深厚，排水良好的砂质壤土栽培。用种子或根茎繁殖，但以根茎繁殖生长快。药材特性：甘草，系豆科多年生草本植物。深秋，荚果裂开，籽粒随风散步大地上，天然繁殖。茎挺拔直立；根如圆柱，直径三四厘米，大的五六厘米，长一米多，最长者达三四米。具体用处：甘草是临床最常应用的药品。生甘草能清热解毒，润肺止咳，调和诸药性；炙甘草能补脾益气，临床用量特大，出口量大。除药用之外，食品上也大量用甘草做糕点添加剂，它的甜度是蔗糖的百倍。西方国家大量进口甘草，从中提取甘草次酸，治艾滋病。甘草退耕还林，水土保持作用更强。陕北农民和西部人们反映，把甘草种子随便撤到地上即可出苗，抗旱性特强。 糖类物质是地球上数量最多的一类有机化合物，是生命物质的组成成分之一。糖类物质广泛地存在于生物界，特别是植物界。糖类物质按干重计占植物的8390，占细菌的1030，动物的小于2。大量药理及临床研究证实：多糖有调节免疫、抗癌、抗肥胖、控制血糖、降胆固醇、降血脂等生理功能，可广泛应用于医药、保健品及功能食品，作为绿色生物医药产品具有广阔的市场前景2。多糖又称多聚糖。其存在于动物、高等植物、微生物(细菌和真菌)及海藻等机体中。多糖具有复杂、多方面的生物活性和功能，可作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，如多糖能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至能抗AIDS病毒3；还具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂作用；促进核酸与蛋白质的生物合成作用；能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老，而且多糖作为药物其毒性极小，因而多糖的研究已引起人们的极大兴趣。尽管我国对多糖的研究起步较晚，但近十几年来的工作取得了较大的进展，愈来多的多糖被发现，并证实它们具有广泛的生物活性4。 多糖是自然界中含量最丰富的聚合物。长期以来,多糖类有效成分重视不够,在天然生物活性成分研究中往往当作杂质被除去。近20 年来,发现多糖具有抗肿瘤和提高免疫作用, 成为国内外研究的一个热点。 多糖具有多种生物活性, 是一种天然的功能性成分。它在食品中的应用十分广泛, 可以用于抑制脂类氧化和稳定酸性饮料中的蛋白质, 并可以作为食品中的乳化成分5。 多糖是水果中一类重要的功能因子，具有抗肿瘤6、抗疲劳7、抗损伤8、抗氧化9 1 0，增强人体免疫力和抗癌的作用。国内外诸多文献对植物中多糖的分离纯化与结构分析进行了大量的研究，目前多糖的分离分析依然是比较活跃的研究领域11。 目前多糖产品开发相当热门，也卓有成效。多糖的生理功能与其纯度和化学结构有着重要的关系，多糖的提取纯化是其研究的基础。因此科学高效地从动植物及微生物中提取、纯化其中的多糖成分是目前的核心问题, 本实验则对甘草的提取与纯化进行探讨与研究，以获得较高提取率的甘草多糖，为甘草多糖的应用研究提供依据。摘要 ：采用水提醇沉法提取甘草中的多糖,通过DEAE纤维素柱层析和SephadexG-100凝胶过滤柱层析分离纯化，用苯酚-硫酸法测甘草多糖的含量，再用薄层色谱法测多糖组分关键词：甘草 多糖 提取 纯化 立论依据 1. 了解甘草多糖的提取与纯化方法 2学会用苯酚-硫酸法测甘草多糖的含量 3. 掌握DEAE纤维素柱层析纯化方法和SephadexG-100凝胶过滤柱层析分离方法 4.学会用薄层色谱法测多糖组分实施路线1 实验材料与方法1.1 实验材料与试剂 甘草 无水乙醇 苯酚 浓硫酸 氯仿 正丁醇 葡糖糖 丙酮 乙醚 蒸馏水1.2 实验仪器 电子天平 破碎机 恒温水浴锅 高速台式离心机 旋转蒸发器 震荡培养箱 真空冷冻干燥机 透析袋 电导仪 紫外分光光度计 器皿： 16个250m l回流锥形瓶 16个100ml烧杯 4个玻璃棒 6支100ml离心管2个1000ml烧杯 保鲜膜 10个培养皿 细线 1ml移液管 2ml移液管 5ml移液管 10ml移液管 100ml 量筒 500ml量筒 2 实验方法2.1 提取工艺 称取定量 干的甘草破碎热水浸提(83,料液比1:10,2h) 加等体积sevage试剂（氯仿：正丁醇4:1）混合震荡(30min)离心分离上清液（4,5000r,10min）浓缩（至原体积1/3）体积比为72%的95%乙醇沉淀静置过夜(24h)离心(4,5000r,10min)沉淀物无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤真空冷冻干燥得啤特果粗多糖（24h）2.2 分离纯化12水相透析 将除蛋白质后的甘草多糖溶解，蒸馏水透析48h,直至透析液电导率小于300us12,说明杂质离子己基本除尽。DEAE纤维素柱层析纯化，DEAE-cellulose52柱层析分离将甘草多糖配制成20mg/ml溶液,微孔过滤后上样，上样体积为10ml, 分布收集, 将各峰收集后浓缩、 冷冻干燥，洗脱条件为0-2mol/l的Nacl溶液梯度洗脱, 流速60ml/h, 苯酚. 硫酸法跟踪检测. 收集器转速为10min/管,将各峰洗脱液经透析直至透析液电导率小于300us，浓缩冻干得不同甘草多糖组分。SephadexG-100凝胶过滤柱层析分离 将不同甘草多糖组分用0.05mol/l的Nacl溶液复溶后配制成6mg/ml溶液， 微孔过滤后上样。 上样体积为10ml,分布收集。 苯酚.硫酸法跟踪检测，收集器转速为12min/管， 各峰浓缩后冻干， 洗脱条件为0.05mol/l溶液洗脱, 流速20ml/h, 柱大小为2cm90cm。 各种型号葡聚糖凝胶的规格、性质 型号G-X颗粒大小（目）吸水量mL/g干胶溶胀度mL/g干胶浸泡时间常温能分级的相对分子质量SephadexG-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200LH-204012040120无定形2080球形100300无定形2080球形 1003004012040120401204012025-100251001.0 0.11.5 0.22.5 0.02.5 0.25.0 0.35.0 0.37.5 0.510 1.515 1.520 2.02.1 (H2O)1.8(乙醇氯仿)232.53.555101012151520304030404 (H2O)33.5(乙醇氯仿)2h2h2h2h3h3h24h3d3d3d至700至15001005000100500050010000500100001000500005000100000500020000050002000001004000（在乙醇中）1002000（在氯仿中）溶剂平衡装柱层析床的检查加样洗脱2.3 甘草中多糖含量的测定苯酚溶液的制备：苯酚溶液的制备取苯酚100g，加铝片01g和NaHCO3，蒸馏，收集180馏分，吸取此镏分16mL加蒸馏水至200mL，置于棕色瓶中放冰箱备用。苯酚-硫酸法13密称取10mg甘草多糖3份，加稀盐酸50mL放在150mL的容量瓶中，水浴水解5h，取出冷却后，加蒸馏水定容到150mL容量瓶中。精密吸取上述溶液1mL置密封试管中，再分别加5苯酚溶液10mL，摇匀，然后加浓硫酸5mL，充分摇匀，于室温放置lOmin，置水浴中加热15min，取出冷却至室温，在490nm处测吸光值。 多糖得率=多糖浓度稀释倍数/样品质量100%葡糖糖标准曲线14标准葡萄糖溶液的制备精密称取干燥恒重的葡萄糖2549mg，用蒸馏水溶解并定容至250mL的容量瓶中，即为10196ug/mL的葡萄糖标准溶液。精密量取葡萄糖标准溶1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL分别置于8个10mL棕色容量瓶中，加蒸馏水定容到10mL棕色容量瓶中，摇匀。精密吸取上述溶液各1mL置密封试管中，再分别加5苯酚溶液10mL，摇匀，加浓硫酸5mL，充分摇匀，于室温放置10min，置水浴中加热15min，取出冷却至室温。另以蒸馏水同上作空白对照，在490nm处测定吸光度。以吸收度(A)值为纵坐标，标准品溶液浓度(C，ug/ml)坐标，绘制标准曲线2.4组分分析将纯化干燥后的多糖封管用2mol/l 的H2SO4在120条件下水解8h,冷却后于50水浴条件下加5%的BaCO3中和， 高速离心后得到上清液， 经浓缩干燥后配成1%的溶液，用薄层色谱法分析上清液的单糖组成.主要步骤：铺层活化点样展开显色薄层分析和制备硅胶GF254制取制备薄板(20 cm 20 cm) 薄层:硅胶G + 0. 5 %的羧甲基纤维素钠：10 g和15mlCMC水溶液混合，调成均匀的糊状物，铺层，在室温干燥后活化(110,1h)，备用。展开体系1 : v (甲苯) v (丙酮) v (甲酸) = 361 ;展开体系2 : v (甲苯) v (丙酮) v (乙酸) = 331 ;展开体系3 : v (乙酸乙酯) v (丁酮) v (甲酸) v (水) =5311 ;展开体系4 : v (甲苯) v (氯仿) v (丙酮)= 402535 硝酸银显色剂：A16AgNO3：丙酮=1：9(VV)；B1NaOH乙醇溶液(WV)：C 6 molL NH3 H20显色：薄板上，先喷试剂A，室温风干，再将薄板浸入试剂B中，等斑点显出后再浸入试剂C中以洗去氧化银，然后用水冲洗1 h，风干，即得棕黑色单糖斑点以v(甲苯) v (丙酮) v (乙酸) = 331 为展开剂,将分离开的3 种组分(荧光检测) ,按色带刮下带有样品的硅胶,分别装柱,用无水甲醇洗脱,以三氯化铁-铁氰化钾检测至洗出液不变色为止. 收集各组分,减压蒸馏,真空干燥,备用.硝酸银显色剂：A16AgNO3：丙酮=1：9(VV)；B1NaOH乙醇溶液(WV)：C 6 molL NH3H20显色：薄板上，先喷试剂A，室温风干，再将薄板浸入试剂B中，等斑点显出后再浸入试剂C中以洗去氧化银，然后用水冲洗1 h，风干，即得棕黑色单糖斑点2.5红外光谱(IR)分析15称取冻干样品2 mg，加入200 mg 干燥的KBr 晶体，在红外灯照射下于研钵中轻轻研磨至极细，用压片机压片，红外分光光度计400 4000 cm- 1中红外区扫描，测定透光率曲线。2.6紫外光谱（UV）分析称取冻干样品10 mg，置100 mI 量瓶中，加双蒸水溶解并稀释至刻度，摇匀。在190 400 nm 区间进行扫描。参考文献：1安树康 皮胎果梨营养成分定量分析 J . 中国食物与营养， 2005( 6): 43- 462朱晓霞，罗学刚多糖提取与纯化技术应用进展J食品研究与开发，2007,28（3）:186-1893陈家童红藻多糖抗AIDS病毒作用的体外实验研究 1998(04)4叶凯贞，黎碧娜，王奎兰，谭志伟多糖的提取、分离与纯化J广州食品工业科技，2004,20(3);144-1455尹艳, 高文宏, 于淑娟 .多糖提取技术的研究进展J 食品工业科技，2007,28(2):248-2506张兰杰， 张维华， 赵珊红 北五味子果实中多糖的提取与纯化研究J鞍山师范学院学报，2002 - 03，4（1）：58-607陈群. 植物多糖免疫调节作用和抗肿瘤活性J 安庆师范学院学报: 自然科学版， 2001，7( 1) : 43 46.8郑素玲，郭立英，范永山. 杏鲍菇多糖对老龄小鼠抗疲劳能力的影响J 食品科学，2010， 31( 7) : 269 271.9史亚丽，杨立红，蔡德华，等. 杏鲍菇多糖对力竭小鼠抗氧化、抗损伤的作用J 体育学刊，2005，12( 1) : 56 58.10李平，王艳辉. 碱提山茱萸多糖的理化性质及抗氧化活性研究J 中草药， 2003( 11) : 11 13