白血病抑制因子mRNA的表达受雌激素的调控 The Expressi.pdf

遗传 HE R E DI T A S B e i j i n g 2 1 2 1 1 一1 3 1 9 9 9 白血病抑制因子 m R NA的表达受雌激素的调控t 卫敏程秋应黄海宁李昌本赵寿元 复旦大学遗传学研究所 上海 2 0 0 4 3 3 摘要运用 R T P C R方法 检测了 体外培养的大鼠 成骨样细胞R o s 1 7 2 8 在 1 7 卢 雌 二醇 E 2 刺激前 后 细胞中一些 细胞因子的m R N A水平 发现 在 E Z 刺激 后 细胞中白 血病 抑制因 子 L I F 的m R N A水 平明 显上升 且呈现E 2 浓度依赖的特 点 该结果提示 L I F 可能参与 替代性 治疗过程中 雌二醇对于 骨质 硫松 症的缓解作用 这为进一步研究细胞因子与骨质疏松症的相关性 阐明细胞因子在骨代谢中的作用打下 了基础 并将有利于发展治疗骨代谢疾病的药物 关键词白 血病抑制因 子 成骨样 细胞 反转录P C R 中图分类号 Q 3 9 T h e E x p r e s s i o n o f L I F i s R e g u l a t e d b y E s t r a d i o l WE I Mi n C H E N G Qiu Y i n g HU A N G H a i N i n g L I C h a n g B e n Z HA O S h o u Y u a n I n s t i t u t e o f Ge n e t i c s F u d a n U n i v e r s i t y S h a n g h a i 2 0 0 4 3 3 A b s t r a c t Wit h R T P C R te c h n iq u e s w e e x a m in e d th e e x p r e s s i o n p a t te r n o f s o m e c y t o k in e s i n r a t o s t e o b l a s t l i k e c e l l l i n e R O S 1 7 2 8 w h i c h w a s s t i m u l a t e d w i t h 1 7 刀 e s t r a d i o l A f t e r t r e a t m e n t t h e o b v i o u s i n c r e a s e o f L I F L e u k a e m i a I n h i b i t o r y F a c t o r m R N A l e v e l i n t h e c e l l w a s o b s e r v e d I t i n d i c a t e s t h a t L I F m a y i n v o l v e i n t h e e s t r o g e n r e p l a c e m e n t t r e a t m e n t o f o s t e o p o r o s i s T h i s w o r k w i l l f o u n d t h e b a s e f o r c l a r i f y in g t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n e x p r e s s i o n o f c y t o k i n e s a n d b o n e r e mo l d e l i n g a n d m a y e v e n f a c i l i t a t e t h e d e v e l o p e m e n t o f d r u g f o r b o n e m e t a b o l i s m a b n o r ma l i t y K e y w o r d s L e u k a e m i a I n h i b i t o r y F a c t o r L I F O s t e a b l a s t l i k e C e l l R T P C R 从胚胎发育到老年时期的整个生命过程中 骨骼始终经历着局部的骨重建过程 b o n e r e m o d e l i n g 以适应机 体的 生长发育及支持功能的变 化 正常骨组织的 维持有赖于骨重建过程中 骨形成 和骨吸收的平 衡 并受 体内 多 种全身性 s y s t e m a t ic 激素 如雌激素等 的调节 2 3 越来越多的证据表明 以前发现的参与 调控细胞增殖 分 化的许多种局域性因子 如 I L 1 I L 6 T N F C S F T G F 刀 等细胞因 子都参与了 各个时 期骨组织生长代 谢的 调控 它们作为 局域性调 节因子 lo c a l f a c t o r s 以自 分 泌 a u t o c r i n e 和 旁分泌 p a r a c r i n e 的 方式调节着骨 内 各 种 细胞的 增殖 分化和活 性 正 是它们介导 至少 部分介导 了 全身性激 素的 效应 构成了 骨形成和骨吸收的 精 细 调节网 络 4 6 随着对细胞因子作用机制认 识的 深人 应用 细胞因子作为 针对某些骨病的 诊断 和治疗方法 具 有 广阔的 前景 本文 报道用反转录P C R R T P C R 方法 检测大鼠 成骨样细胞株 R a s 1 7 2 8 在 1 7 3 雌二 醇刺 激 前 后细胞中白 血病抑制因 子 L e u k a e m ia I n h ib i to r y F a c t o r L I F 的m R N A水平 并就L I F 在雌二 醇替代治疗 骨质疏松症中的作用作了初步探讨 卫本项 目得到国家教委博士点基金资助 遗传 HE R E DI T A S B e i j i n g 1 9 9 9 2 1 卷 1材料和方法 1 1细胞株R OS 1 7 2 8 来源于大鼠骨肉瘤 培养基 H a m F 1 2 9 5 F C S 5 0 8 m m o l L C a C I 2 8 m m o l L H e p e s b u f f e r 雌二醇 1 e s t r a d io l E 2 ME R K公司产品 溶解于9 5 乙 醇 配制成1 0 z m o l L的 储备液 以2 5 x 1了细 胞 厘米 铺板 3 7 C 5 C O 培养 待细胞贴壁后加人雌二醇 实验中选取雌二醇刺激浓度 0 9 5 乙醇 I 0 2 m o l L 1 0 7 m o l L 1 0 9 m o 1 L 1 0 m o l L 使用时均以 1 0 0 0 倍稀释至终浓度 细胞加雌二醇 刺激 2 天 培养至7 0 8 0 0r 瓶壁 被细胞所覆盖 以避免细胞产生接触抑制 收获细胞以制备细胞总 R N A 1 2细胞及组织总 K N A抽提 异硫氰酸肌 一 酸酚一 步法抽 提细胞总R N A n 含甲 醛的变 性琼 脂糖 凝胶电 泳 UV 检测R N A质 量和浓 度 1 3转录和 P C R检测 转录S u p e r s c r ip t I I S y s te m G I B C O B R L公司 试剂盒 按说明书 操作 P C R检测 F DD K 1 D NA扩增试剂盒 按说明书操作 1 刀 a c t i n 大鼠 引物 1 5 T C A T GA A GT G T GA C G T T GA C A T C C G T A A A G 3 弓 物 2 5 C CT AGAAGCA TT T GC GGT GCAC GAT GGAGG 3 从 成熟m R N A的反转录产 物中 预计可扩增出2 8 5 b p 的片 断 2 T r a n s f o r mi n g Gr o w t h F a c t o r T GF fl 1 大鼠 引物 1 5 A A T A C GT C A GA C A T T C G GG A A 3 引物 2 5 GTC AAT GT ACA GC T GC C GT AC 3 从 成熟rn R N A的反转录产 物中预 计可扩增出4 9 8 b p 的片断 3 L e u k a e m i a I n h i b i t o r y F a c t o r L I F 大鼠 引物 I 5 CAAT GC CC T CT T T AT T T C CT AT T AC AC AGC 3 引物 2 5 GGGGACA CAGGGC ACA T CCA CAT GGCC C AC 3 从 成熟 m R N A的 反转录产物中预 计可扩 增出3 3 3 b p 的片断 P C R反应 9 5 1C 12 0 s 9 3 C 4 5 s 5 5 1C 4 5 s 7 2 C 6 0 s o 循 环 7 2 C 4 0 0 s 进行P C R扩增 以1 0 琼脂 糖凝 胶电 泳 检测 2结果和讨论 正常培养条件下 在成骨样细胞株中几乎检测不到 L I F mR NA 在雌二醇处理后 L I F mR N A水平有较明 显的上 升 以 3 a c t i n 为内 对照 且 显示出雌二醇浓度依赖的特 点 图 1 同 时 我们检测一f 雌二醇刺激前后该 细 胞株中T G F 脚 的 m R NA水平 其表达量较 L I F高且未见明显变化 见图 1 雌二醇是一种重要的全身性骨代谢调节激素 在激素替代性疗法中用于缓解绝经后妇女的骨质疏松症状 雌 二醇处理的成骨样细胞株中发现 L I F m R NA水平上升是一非常有趣的现象 提示 L I F的表达 至少部分 受到 雌二醇的调控 它可能参与机体的骨代谢调节过程 另外 我们发现 L I F在正常三月龄大鼠的骨髓细胞和骨干 组织中都有表达 未发表资料 目前关于 L I F对骨重建过程作用的研究还刚刚起步 从现有结果看 L I F对骨细胞的影响可分为两个方 1 M I lla 9 6 W T 3 q I L v M C S F G C S F等 参与调节了 前体破骨细胞的 发育成熟 乃1 接刺激成熟破骨细胞 上调其骨吸收活性 已经有实验表明 当GM C S F不存在或延迟出现时 L I F对正常的 造 血祖细 胞 的促分化作 用 分 化 为 G M C S F依赖 的 C F U GM 会加速 C F U G M C o l o n y F o r m i n g 1 2 2 期卫敏等 白血病抑制因子 m R N A的表达受雌激素的调控1 3 U n it G r a n u lo c y te Ma c r o c y t e 的死亡 E 可下 调骨内 成骨细胞或其他骨细胞I L 6 C S F 等的分泌 而 这些细 胞因 子是造血骨细胞分化为破骨细胞 破骨细胞由C F U G M 和 成熟巨 噬细胞分化而 来 的重 要调节因 子E z 可能通过刺激成骨细胞产生 L I F 促进前体破骨细胞分化 同时又下调其它一些破骨细胞成熟所必需的细胞因 子 导致成熟破祖细胞的产生受阻 从而抑制骨吸收 图 1 细胞总 R N A的反转录 P C R检测 卜a c t in 丁 G F 刀 和L I F的结果 l R O S 1 7 2 8 E 2 1 0 m o l L L I F 2 R O S 1 7 2 8 E 2 l 0 m o l L L I F 3 R O S 1 7 2 8 E 1 0 m o l L L I F 4 R O S 1 7 2 名 E 2 0 L I F 5 R O S 1 7 2 8 E 2 1 0 m o t L 一 丁 G F 卢 6 R O S 1 7 2 8 E Z 1 0 9 m o l L T G F 声 7 R O S 1 7 2 8 E 2 1 0 co o l L 一G F 刀 8 R O S 1 7 2 8 E 2 0 一 丁 G F P 9 R O S 1 7 2 8 E 2 1 0 m o l L fi a c tin 1 0 R O S 1 7 2 8 E 2 l 0 9 m o 1 L fl a c ti n 1 1 R O S I 7 2 8 E 1 0 m o l L fi a c t in 1 2 R O S 1 7 2 8 E 2 0 3 a c ti n M p X 1 7 4 H a e l l l D N A M a r k e r 已知T G F 刀 在成骨样细胞中有表达 它也参与骨代谢的调控 e 我们也检测了该细胞中T G F 刀 的 m R N A水平作为检测细胞中细胞因子 m R N A水平的一个对照 深人研究 L I F对骨代谢的调控 阐明其在 E 替 代疗法 R e p la c e m e n t T h e r a p y 治 疗骨质疏松症中的 作用 将为发展针 对骨质疏 松的 诊疗手段打下 基础 参考文献 1 F r o s t H M I n t e r me d i a r y Or g a n i z a t i o n o f t h e S k e l e t o n 1 9 8 6 C RC P r e s s 2 Ri g g s B L Me l t o n L J 3 d I n v o l u t i o n a l o s t e o p o r o s i s T h e Ne w E n g l a n d J o u r n a l o f Me d i c i n e 1 9 8 6 3 1 4 2 6 1 6 7 6 一1 6 8 4 3 T u r n e r R T e t a l S k e l e t a l e f f c t s o f e s t r o g e n E n d o c r i n o l o g y 1 9 9 4 1 5 3 2 7 一3 0 0 4 Mu n d y G R Cy t o k i n e s a n d l o c a l f a c t o r s w h i c h a f f e c t o s t e o c l a s t f u n c t i o n I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f C e l l Cl o n i n g 1 9 9 2 1 0 4 2 1 5 2 2 2 5 L o r e n z o J A T h e r o l e o f c y t o k i n e s i n t h e r e g u l a t i o n o f l o c a l b o n e r e s o r p t i o n C r i t i c a l r e v i e w s i n I mmu n o l o g y 1 9 9 1 1 1 3 一4 1 9 5 一2 1 3 6 Go w e n M Cy t o k i n e s a n d B o n e Me t a b o l i s m 1 9 9 2 CR C P r e s s Go u g h N M Ra p i d a n d q u a n t i