△Np73基因蛋白在食管鳞癌中的表达及其临床意义.doc

Np73基因蛋白在食管鳞癌中的表达及其临床意义张月峰1 张云杰2、3 李保庆1 单保恩4 范增林2 李勇1（1河北医科大学第四医院胸外科2河北省磁县医院胸外科 3河北医科大学硕士生4河北医科大学第四医院科研中心）摘要 目的：应用流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测食管鳞癌组织中Np73蛋白的表达，以探讨它与食管鳞癌的临床病理特征的关系。方法：选取2005年1月至2006年12月在河北医科大学第四医院胸外科住院手术的食管癌患者47例，制备单细胞悬液，采用间接免疫荧光标记法用Np73多克隆抗体对细胞进行染色，应用FACS-420型流式细胞仪进行分析。 结果：食管癌组织中Np73表达阳性率明显高于癌旁组织、正常组织(P均0.05)。结论：Np73蛋白的表达变化可能与食管癌的发生发展有关。关键词：食管癌；Np73蛋白；流式细胞术(FCM)The expression of protein Np73 in squamous cell carcinoma of the esophagus and its clinical significancesZhang Yue-Feng, Zhang Yun-Jie, Li Bao-Qing, et al. Department of Thoracic Surgery, The Fourth Hospital of Hebei Medical University.Abstract: Objectives Flow cytometry (FCM) was employed in this paper to detect the expression of protein Np73 in squamous cell carcinoma of the esophagus, with the aim to explore the correlation of Np73 to clinopathological data. Methods A cohort of 47 cases of esophageal cancer were selected from Department of thoracic surgery, the fourth hospital of Hebei medical university. Monoplast suspension was prepared. Then, the cells were immunofluorescent stained by polyclonal antibody against Np73. Finally, the cells were analysed by FACS-420 flow cytometer. Results The ratios of Np73 positive expression in the tissues of esophageal cancer were higher than that of paracancer tissues and normal tissues (all P0.05). Conclusion The expressing change of Np73 gene many have some correlation with the occurrence and development of esophageal cancer. Key Words: esophageal cancer; protein Np73; flow cytometry (FCM)近年来，人们对参与肿瘤发生发展及转移的各种基因不断进行研究，取得了许多成果。Np73基因被认为是一种致癌基因，可以负性调控p53及全长型p73 (TAp73)的功能，它在多种恶性肿瘤发生发展中起重要作用。本研究应用流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测47例食管鳞癌Np73蛋白的表达，以探讨它与食管鳞癌的临床病理特征的关系。1 材料与方法1.1 一般资料 选取2005年1月至2006年12月在河北医科大学第四医院胸外科住院手术的食管癌患者47例，其中男性36例，女性11例；年龄4374岁，平均年龄（58.917.61）岁；吸烟史400年支23例，5cm 14例，5cm 33例；分化程度：高、中分化40例，低分化7例；淋巴结转移：无转移27例，有转移20例；病理分期（按1997年UICC的TNM分期）：、期13例，、期34例。于术中离体半小时内取其癌组织、对应的癌旁组织（距肿瘤边缘约2 cm）和正常食管组织（距肿瘤边缘5 cm）置入70%的乙醇固定，保存于4冰箱。所有肿瘤组织均经病理学确诊为鳞状细胞癌，正常食管组织经病理证实为炎症或正常鳞状上皮。全部病例术前均未行放化疗。1.2 研究方法 留取标本经生理盐水充分冲洗后以搓网法制备单细胞悬液，采用间接免疫荧光标记法用1:100稀释的兔抗人Np73多克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司产品)对细胞进行免疫荧光染色；37水浴30min，离心洗涤后加入羊抗兔PE-IgG (美国Santa Cruz Biotechnology公司产品)染色，37水浴30 min，离心洗涤，400目筛网过滤后检测。应用美国BD公司生产的FACS-420型流式细胞仪，进行单参数分析；测定数据和图形应用相应的软件程序进行资料处理。检测前以flow-check Flouropheres (10m)荧光微球(REF 6605359. Beckman Coulter公司)作为标准样品调整仪器CV值在2以下。1.3 结果判定 参照Morkve等和Kelsten等提出的荧光指数1 (Fluorescence Index, FI)表示Np73的相对含量。FI=(实验样品的荧光强度对照样品的荧光强度)/正常食管粘膜细胞的荧光强度。定性分析以FI1.0为阳性表达，FI1.0为阴性表达。1.4 统计学处理所有数据经过 SPSS 13.0 版统计软件进行分析处理，根据数据类型分别采用t检验、卡方检验及Fisher 精确检验。以P0.05为差异在统计学上有显著性意义。2 结果2.1 食管癌组织、癌旁组织及正常组织中Np73蛋白的表达情况 47例癌组织中有39例(83.0)Np73蛋白表达阳性，而对应癌旁组织有15例(31.9)表达阳性，食管正常组织中有23例(48.9)表达阳性。癌组织阳性表达率明显高于癌旁和正常食管组织(卡方检验和t检验P均0.05, 卡方检验)，(见表1)。Table 1 Expression of Np73 protein in different esophageal tissues食管组织nFI()阳性数（）癌组织471.20360.312039(83.0)癌旁组织470.89040.366215(31.9)*正常组织471.00000.418923(48.9)*与癌组织比较卡方检验和t检验P均0.052.3 食管癌组织中Np73蛋白的表达与病理资料的关系 T12期食管癌患者与T34期食管癌患者的食管癌组织中，Np73的表达水平分别为1.40370.1964和1.13570.3281，经统计学处理，两者存在显著性差异(P0.05)（见表3）。Table 3 Relationship between Np73 protein expression with tumor size, infiltrate depth, grade of pathology, TNM stage, lymph nodes metastasis in esophageal carcinoma食管癌患者nFI（）阳性例数（）肿瘤大小5cm211.19190.381530（76.2）5cm261.23460.26229（88.5）浸润深度T12141.40370.196414（100）*T34331.13570.328125（75.8）*分化程度高、中分化401.20340.326333（82.5）低分化71.28490.27636（85.7）TNM分期、期131.28180.276013（100）、期341.14640.349326（76.5）淋巴结转移无271.25860.253425（89.3）有201.15740.388214（73.3）*卡方检验P=0.043, t检验P=0.007。其余各组P均0.053 讨论最近研究发现，p73基因具有复杂的蛋白异构体形式，各种异构体具有不同甚至截然相反的转录活化潜能和凋亡诱导活性。缺失N末端反式激活区域的p73剪接异构体TAp73的转录活化功能完全丧失，从而成为全长p73功能的显性负性因子，对p73的促凋亡功能具有拮抗的作用2, 3。其中对Np73 的功能研究得最为深入。Np73 是缺失转录激活域的 p73 剪接异构体，有研究发现其对 p53和 p73 的转录活性、介导的内源靶基因的产量及促凋亡活动均有抑制作用4, 5，而且可以影响细胞的恶性转化过程6。Np73通过与p53竞争DNA结合部位和与TAp73直接结合，能够阻抑野生型p53和TAp73的功能，从而抑制凋亡7, 8。Stiewe等6发现，TA-p73蛋白（包括Np73蛋白）的过表达可导致NIH3T3成纤维细胞的恶性转化，TA-p73通过引发细胞内信号串联导致细胞转化和肿瘤发生。Stephanie等9应用免疫组化技术研究发现，Np73蛋白在颈部鳞状细胞癌呈过表达，明显高于正常组织，蛋白也呈过表达，且Np73蛋白的表达与肿瘤的放疗敏感性呈负相关。Robert等10应用Western blotting方法研究发现，Np73蛋白在成神经细胞瘤中过表达。本研究对47例食管癌患者Np73蛋白表达的FCM分析，发现食管癌组织中Np73蛋白表达FI值明显高于对应的癌旁组织和正常食管组织，说明Np73蛋白在食管癌中可能起着与其他组织恶性肿瘤相似的类似癌基因的作用。通过对食管癌组织中Np73表达阳性的标本分析发现，食管癌浸润深度T12期食管癌患者在转录水平Np73 FI值比相应的T34期食管癌患者显著增高，提示随着食管癌浸润深度的增加，Np73表达水平相应降低11。以上研究提示，Np73可能在食管癌恶性演进的早期阶段发挥着重要角色。Np73表达水平与食管癌组织的大小、癌细胞的分化程度、TNM分期、有无淋巴结转移以及患者的性别、年龄、吸烟史、饮酒史、家族史等因素不存在相关性。本研究还显示Np73基因的表达水平与食管癌的浸润深度呈负相关。Yasuhiro等11报道，Np73蛋白的表达与甲状腺乳头状癌的浸润深度呈负相关，这与我们的研究结果一致。但他们还发现Np73蛋白的表达与肿瘤大小和临床转移也呈负相关。这与我们的研究结果不一致，我们未发现Np73表达与肿瘤大小和临床转移及其它临床病理生理特征有关。考虑其原因：可能与组织特异性及样本例数大小有关。食管癌组织中Np73基因表达增高的原因可能有两种情况：一是食管癌发生过程中Np73基因发生变化；二是促进Np73 基因表达的因子的激活作用。国外研究者发现，Np73基因可以通过与p53基因和TAp73基因竞争下游的DNA连接序列，从而对p53基因和TAp73基因功能发挥负调控作用12，在肿瘤细胞中Np73基因发挥着一个癌基因样促进肿瘤生长的作用，可以作为一个肿瘤分子治疗的靶点。这是值得我们重视并需要进一步研究的问题。参考文献1 Morkve O, Laerum OD. Flow cytometic measurement of P53 portein Expression and DNA content in pareffin embeded tissue from Bronchical carcinoma. Cytometry, 1991,12(4):4384442 Stiewe T, Theseling CC, Putzer BM. Transactivation- deficient DeltaTA-p73 inhibits p53 by direct competition for DNA binding. J Biol Chem，2002，277(16)Stiewe T, Zimmermann S, Frilling A, et al. Transactivation- deficient TAp73 acts as an oncogene. Cancer Res, 2002, 62(13):359836024 Zaika AI, Slade N, Erster SH, et al. DeltaNp73, A dominant-negative inhibitor of wild-type p53 and TAp73 is up-regulated in human tumors. J Exp Med, 2002, 196(6): 7657805 Pozniak CD, Radinovic S, Yang A, et al. An anti-apoptotic role for the p53 family member, p73, during developmental neuron death. Science, 2000, 289(5477):3043066 Frasca F, Vella V, Aloisi A, et al. p73 gene mutations in gastric adenocarcinomas. Cancer Res, 2003, 63(18):5829 5837 7 Ishimoto O, Kawahara C, Enjo K,et al. Possible oncogenic potential for DeltaNp73: a newly identified isoform of human p73. Cancer Res, 2002, 62(3):6366418 Zaika AI, Slade N, Erster SH,et al. DeltaNp73: a dominant-negative inhibitor of wild-type p53 and TAp73, is upregulated in human tumors. J Exp Med, 2002, 196(6):7657809 Stephanie S, Kelvi