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两种凝血酶原提取方法的比较 两种凝血酶原提取方法的比较作者：赖翼吴民泸代娟陈曼段佳慧刘阳【摘要】目的比较等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法从猪血浆中提取凝血酶原的纯度。方法分别采用等电点沉淀法和梓檬酸钡吸附法从猪血浆中提取凝血酶原，凝血酶原经单独钙离子激活得到凝血酶，通过凝血酶效价测定、蛋白质浓度测定，计算出凝血酶的比活性。结果采用等电点沉淀法提取的凝血酶原经激活后得到的凝血酶比活性为11. 01土1. 54 U/mg,采用梓檬酸钡吸附法提取的凝血酶原经激活后得到的凝血酶比活性为130. 17土12. 30 U/mg,经配对T检验，PC0.01.结论与等电点沉淀法相比，采用梓檬酸钡吸附法从猪血浆中提取得到的凝血酶原纯度更高。【关键词】凝血酶原；凝血酶；等电点沉淀法；柠檬酸钡吸附法Abstract Objective To compare the purity of prothrombinpurified by method of precipitating at isoelectricpoint andadsorption method with barium citrate from blood plasma ofpig. Methods Prothrombin was purified by method of precipitating atisoelectricpoint and adsorption method with barium citrate from bloodplasma of pig and activated by Ca2+ only to thrombin. Then the titerof thrombin and the concentration of protein were measured to get thespecific activity of thrombin. Results The specific activity ofthrombin activated by Ca2+ from prothrombin purified by method ofprecipitating at isoelectricpoint was 11. 01 + 1. 54 U/mg. The specificactivity of thrombin activated by Ca2+ from prothrombin purified byadsorption method with barium citrate was 130. 17 + 12. 30 U/mg. Thespecific activities were analyzed by paired T test, P<0. 01. Conclusion The purity of prothrombin purified by adsorptionmethod with barium citrate is higher than purified by method ofprecipitating at isoelectricpoint.Key words】 prothrombin; thrombin； method of precipitatingat isoelectricpoint； adsorption method with barium citrate凝血酶是参与机体凝血过程的一个重要的凝血因子，在体内以凝血酶原形式存在1。20世纪中期开始人们将凝血酶应用于临床，由于其疗效显著，应用也越来越广泛。之后美英日等国从牛血浆中分离出凝血酶应用于临床，并证明将动物凝血酶应用于人体未出现凝血酶抗原性，口服和周部外用时无过敏反应和其他不良反应等，因而目前所使用的凝血酶制剂大多来源于动物血浆，国内采用猪血浆制备凝血酶的报道较多2。等电点沉淀法和梓樣酸钡吸附法是两种主要的凝血酶原提取方法3，凝血酶原经单独的钙离子激活可得到凝血酶。目前，国内尚无研究比较应用等电点沉淀法和梓檬酸钡吸附法所得到的凝血酶原纯度的差异，哪种方法得到的凝血酶原纯度更高？更适合用于提取 归处理，并求得直线回归方程，所得方程式为：Y=62.913 5.994X,r=?0. 994 8.将凝血酶样品的凝固时间代入回归方程，即可计算得出样品的凝血酶效价(见表1、图1)。采用等电点沉淀法得到的凝血酶原经激活后，凝血酶的比活性为11. 011.54 U/mg，而采用柠檬酸钡吸附法提取得到的凝血酶原经激活后，凝血酶的比活性可达到130. 17土 12. 30 U/mg。其比活性经配对样本t检验统计学分析后，其概率P=3.54X10 5<0. 01,说明两种方法得到的凝血酶比活性有显著性差异，后者约为前者的11.8倍。从两种方法所得到的凝血酶溶液的酶活性和蛋白质浓度分析，造成两者酶比活性差异的主要原因在于凝血酶的纯度差异，凝血酶纯度越高，比活性就越高。等电点沉淀法提取的凝血酶原溶液含杂蛋白较多，需要进一步纯化，以提高酶的比活性。因而，采用柠檬酸钡吸附法从猪血浆中提取凝血酶原大大优于等电点沉淀法，得到的凝血酶纯度较高。3讨论从血浆中提取的凝血酶可应用于临床，作为局部止血的首选药物，具有止血快、无副作用的优点。同时，凝血酶也是纤维蛋白原定量检测试剂盒的主要成分，应用于出凝血疾病和血栓性疾病的临床检测7。由于人血浆资源的限制性，目前国内采用猪血浆提取凝血酶的报道较多，等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法是两种主要的凝血酶原提取方法，凝血酶原经单独的钙离子激活即可得到凝血酶。表1两种提取方法所得到的凝血酶比活性等电点沉淀法根据蛋白质在溶液pH为其等电点的条件下溶解度最低的原理，用1 %的醋酸将适当稀释后的血浆pH调至凝血酶原的等电点5.0?5. 5之间，即可使凝血酶原析出。该方法虽然操作简便，成本较低，但得到的凝血酶含杂蛋白较多，比活性低，达不到临床药物和检测试剂的纯度要求，还需要进一步的纯化，而纯化步骤越多，酶的回收率则相应降低，不能有效的利用资源。柠檬酸钡吸附法则根据柠檬酸钡能吸附依赖于维生素K的凝血因子这一特性，在柠檬酸钠抗凝获得的血浆中加入氯化钡产生梓樣酸钡，凝血酶原等因子随之沉淀分离出来，沉淀用EDTA解吸附，离心去沉淀，上清液经透析后获得凝血酶原溶液。虽然该方法看似操作较为复杂，但得到的凝血酶纯度较高，可直接用于检测试剂的制备，也可根据目的选择进行中度纯化，相比等电点沉淀法其回收率更高，实际上节约了成本。另外，无论是等电点沉淀法还是柠檬酸钡吸附法，最后含有凝血酶原的蛋白沉淀的复溶过程是影响凝血酶得率的一个关键步骤。在梓樣酸钡吸附法中，用EDW解吸附凝血酶原 应在冰浴中搅拌0.5 h以上，直至溶液呈现胶冻状态为止，使凝血酶原充分溶解于缓冲液中。【参考文献】1 张智明.凝血酶的研究进展J.海峡药学,2001 18(6): 1 3.2 施大林，陆茂林,吕惠敏,等.猪血凝血酶的制备J.生物技呆,200212(1) : 18.3 宋宏新,马永征,李敏康.凝血酶分离纯化方法的研究进展J.食品研究与开发004，25(6): 65 67.4 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药典三部M ?北京：化学工业出版社，1995，1 12