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文档简介

SSCP实验步骤一 聚丙烯酰胺凝胶的制备一般情况下，用12%的聚丙烯酰胺凝胶分离待测片段。根据玻璃板规格的不同（1.0、1.5两种），分别配制7ml、10ml的胶，配方如下表：7ml（1.0板）10ml（1.5板）配方H2O3.434.93Acr/Bis2.1340% (Acr29:Bis1)5TBE1.4254.0gTris+27.5g硼酸+4.65g EDTA定容至1L，PH约8.3AP0.0700.07010%过硫酸铵：1g过硫酸铵融入10ml水中，冷藏TEMED0.0050.0051%四甲基乙二胺：聚合加速剂备注：1 配胶前将玻璃板洗干净，擦干。 2 标号为2的电泳槽有时接触不良，不提倡用其做SSCP。 3 待30min后，胶凝固，用保鲜膜包好放冰箱冷藏。 4 标着“坏”的制胶器，只能用于制1.5规格玻璃板的胶。二 样品的制备1、 设计引物，样品片段长度一般因在150-300bp之间。2、 PCR扩增目的片段，琼脂糖凝胶检测。3、 样品稀释。根据琼脂糖凝胶检测结果，如果PCR产物很浓（与marker一样亮），则将PCR产物稀释3倍；若PCR产物浓度较弱，则可以不稀释。4、 取1 l 稀释好的PCR产物，加入9ul 变性缓冲液中，混匀。变性缓冲液：溴酚蓝5mg，0.5M EDTA. Na2 (pH8.0 ) 400l，甲酰胺9.6ml，混匀。三 变性1、 开启PCR仪，将程序设置为98 11min2、 将混有甲酰胺的样品放入PCR仪中，开始变性3、 准备冰盒4、 当变性10min时，打开PCR仪，迅速将样品插入冰中，保持10min四 上样电泳1、 电泳前，所用的胶，电泳缓冲液（1TBE）都要先预冷。2、 取样品3l，依次点到事先制好并且制冷的聚丙烯酰胺凝胶中。点样时注意标准品不要点到胶的最边上两个孔，以免由于制胶不均匀或其他原因造成的标准品分型不好，起不到指示作用。3、 将电泳槽放到4 冰箱中，连上电泳仪，250V跑10min，50V 16h注：电泳条件因待分离片段的不同而不同，因此若以上条件不能够将不同的基因型分开，则可以尝试其他的条件。五 染色 1、固定。把胶卸下，做好起始记号，放入约80ml固定液（50ml无水乙醇，2.5ml冰乙酸，定容到500ml，冷藏）中在摇床上固定10min。2、染色。60ml染色液（0.75gAgNO3，溶入500ml水中，避光保存）+60l甲醛， 染色6min。蒸馏水洗涤一次。3、显色。60ml显色液（7.5g NaOH，溶于500ml水）+120l甲醛，放到摇床上显
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