声带的细胞生理学(投稿)[4].doc

声带的细胞生理学研究进展 张雷 作者单位：310016 杭州，浙江大学医学院附属邵逸夫医院耳鼻咽喉-头颈外科通信作者：张雷，Email: dr_姜秀文声带由不同类型组织组成，包括上皮、固有层、横纹肌、神经、血管和软骨，为多层结构，每层都有不同的作用。固有层是其中的重要结构，分为浅层、中层和深层，浅层下为Reinkes间隙，中层主要由弹性纤维组成，而深层主要由胶原纤维组成，后两层合称声韧带。深层的深面为甲杓肌，形成声带的主体。在声带的前端，固有层的中间层增厚形成一卵圆形的结构，称为前黄斑，由弹性纤维、纤维母细胞和基质组成，形成一网状结构。两边的前黄斑之间主要由胶原纤维组成，成为前联合。声带膜部的后端，固有层的中间层在这里又形成卵圆结构，成为后黄斑，结构与前黄斑相似，与杓状软骨的声带突相连。发声过程中，声带振动最明显的是Reinkes间隙，大多数声带病变起源于固有层，如果这一层出现炎症、新生物和瘢痕，声带就会变得僵硬，振动就会受到影响，音质就会发生改变。 本文重点就近年来有关声带上皮和固有层的细胞生理学研究进展进行综述。一.上皮声带被覆复层鳞状上皮，而喉的其他部位为假复层柱状纤毛上皮。鳞状上皮细胞一直保持着代谢性功能，直至脱落。顶面老化的细胞脱落掉进喉腔，新细胞由基底细胞分化产生，向上、向中间移动，取而代之。这些代谢活跃的细胞中水的转运规律，对水的渗透性及其程度尚在研究之中。鳞状上皮表面细微皱起，其用途尚不完全明确。有些研究人员认为这增加了表面积，有助于黏液的吸附和水的吸收，或者在声带振动过程中有助于牵引（就像轮胎的皱纹可以防滑一样）1。覆盖于上皮的黏液层，又称黏液毯，分为两层：黏蛋白层和浆液层。黏蛋白层靠腔面，充满不同的黏蛋白分子。其部分用途是为了防止下面的浆液层和纤毛、细胞的水分丢失，黏蛋白层中的分子可以保护下面的结构。浆液层是黏膜纤毛毯层，它直接与纤毛接触，拥有大量水分。纤毛在粘滞性低、水分多的浆液层中，比在粘滞性较高的黏蛋白层中更容易运动。在气管中，黏膜纤毛毯随着纤毛不断地向后、上摆动，以循环的形式向上运动。黏液毯的移动在一个循环中总是向后和向上的，一旦其到达气管后部，它就直接向上并通过后声门。用人类和狗做实验，追踪被喷进或吸入气管的小微粒的运动，可以描绘出黏液纤毛毯的运动模式。被直接喷到声门下的脱脂棉颗粒越过声带表面，实际上被黏膜纤毛毯推过了无纤毛的鳞状上皮表面。离声带上缘大约2-3mm处，鳞状上皮又变成假复层柱状纤毛上皮。在这里，黏液毯继续向后向上运动，直至越过后声门，黏液被吞下。黏液纤毛毯的运动形式也许可以解释某些喉部疾病（如结核和慢性真菌感染，通常出现在后声门）发生在特定倾向性位置原因。 在健康人中黏膜纤毛毯沿气管上行速度为4-21mm/min，这种移动和潮湿的黏膜纤毛毯在正常情况下保持了声带的健康和湿润。然而，许多因素可以使黏膜纤毛毯变干或瘫痪或部分减慢纤毛运动，这样就损伤了黏膜纤毛毯的功能。例如，已经证明吸一口烟就能够减慢其清除速度。清除减慢会使黏液暴露于更多的毒素和炎症因子中并使之脱水。而且，黏稠的或脱水的黏膜纤毛毯使得纤毛变得更难于运动，这样更加减慢了运动。其他周围环境，例如寒冷或干燥，可减弱黏膜纤毛毯的清除能力。纤毛被破坏或损伤，其修复时间可能需要数小时到3周。总之，黏膜纤毛毯是保证声音健康的一个最重要的条件。光滑、潮湿而快速运动的黏液毯使声带保持潮湿、润滑。为了考察上皮组织对食道返流的缓冲能力，近年来有很多学者进行了喉上皮中碳酸脱水酶（carbonic anhydrase, CA），胃蛋白酶的检测。发现在正常喉上皮中存在CA同工酶、和，提示喉黏膜在喉咽反流中存在自身防御机制。进一步的实验表明，在反流性喉炎患者中，声带黏膜 CA-III表达下降，而在杓间区升高。提示胃酸反流时声带黏膜CA-III耗尽后声带上皮缺少防线，声带组织对食道反流的缓冲能力较杓间区差，增加了声带受损的可能性2 3。Johnston检测9例咽喉反流疾病患者声带或室带中的胃蛋白酶，其中8例有阳性表达，而在正常对照组（12例）中均未检测到。认为胃蛋白酶的出现与CA-III的消耗有关，在喉咽反流疾病中，胃蛋白酶的出现是CA-III耗尽的原因，导致喉黏膜的炎性损伤4 。研究表明，室带成纤维细胞基因表达与环后区黏膜完全不同。胃酸的有害影响，对环后区组织比室带组织更敏感，而且，在环后区胃酸和胃蛋白酶有协同效应5 。二. 基底膜区上皮作为一个保护性的覆盖物有助于维持固有层的形状和两者之间的协调性。上皮通过基底膜区来保护固有层。基底膜区是一个蛋白和非蛋白结构的集合体，这种结构有助于基底细胞与固有层中的相对无定形蛋白团块共存。上皮当然主要是细胞，这些细胞通过细胞桥粒相互连接，细胞桥粒是邻近细胞的细胞骨架之间的附件。这些附件足以抵抗皮肤和声带接受的撞击；固有层是纤维和非纤维结构的非常疏松地连接，主要是非细胞性的。以细胞为主的上皮必须保护自己及非细胞为主的固有层，机体已经用基底膜区解决了这一问题。实质上，基底细胞有锚定的细丝，它们能稳定半桥粒于基底膜致密层和稀疏层，主要由型胶原组成，从而保证上皮在强烈的振动过程中稳定于固有层上。良性喉部病变中常可发现基底膜的破坏及分解。有研究表明基底膜区的一些蛋白，如胶原型是受遗传影响的，例如锚定纤维的数目（锚定纤维的种群密度）是受遗传决定的6。一般人的基底膜区或许每单位面积有80-120个锚定纤维，而对于某些个体由于编码该蛋白的基因处于相对静止状态而无法表达足量的锚定纤维，则也许仅有40-60个锚定纤维/单位面积。说明一些遗传因素可能使个体易患某一特定的声带疾病。例如，含锚定纤维较少的人可能更易于患声带小结。有关遗传因素与声带疾病易感性的关系尚未建立，是否在声带小结的形成中锚定纤维的缺乏起决定作用尚未知。然而，锚定纤维密度的遗传决定性的确提出了一些令人感兴趣的问题，并且指出遗传也许影响声带健康和疾病。三.固有层（lamina propria,LP）LP是介于声带上皮与声带肌之间的纤维结缔组织，包括浅表层（superficial layer of the lamina propria,SLLP），中间层（middle layer of the lamina propria,MLLP）、深层（deep layer of the lamina propria,DLLP），是与声带的发音功能直接相关的重要组织结构。SLLP由少量弹力纤维、胶原纤维组成；MLLP主要由弹力纤维组成；DLLP弹力纤维较MLLP少，而胶原纤维更多，MLLP和DLLP共同组成了声韧带。声带上皮及SLLP构成声带的包膜部（cover）,而DLLP及声带肌合称为声带本体部（body），MLLP称为过渡部。任克氏间隙是位于声带上皮层与固有层浅层下的一个潜在性间隙。这些纤维与声带边缘走行相平行。它是固有层的一个承受纵向压力的区域，因此声韧带含有大量的胶原纤维。声韧带仅存在于成年人，在儿童及动物中不存在。LP也可以通过生物学成分来划分，分为细胞成分和非细胞成分，非细胞成分称为细胞外基质（extracellular matrix,ECM）。因此，声带固有层又可被分成声带固有层细胞和细胞外基质。1.任克氏间隙（Reinkes space , RS）任克氏间隙是一个具有高度特异性的结蒂组织屏障，位于声带上皮层及固有层前层和声韧带之间，全层几乎没有淋巴引流，由德国解剖学家Reinkes（1895）首先描述。由纤维蛋白和成纤维细胞、细胞外基质组成，其中ECM是形成正常黏膜波极其重要的成分。新生儿的任克氏间隙类似于成人LP的浅表层，但不存在成人声带黏膜可见到的精细的三维网状纤维结构，也没有网状纤维和其他胞外基质如弹性纤维、粘多糖（蛋白多糖）的复合体。因此其粘弹性较成人差。在新生儿声带的RS中活性的成纤维细胞相对稀少，但密度大于成人，它在声带膜部处于静止期7。成人结构正常的任克氏间隙表现为声带振动和黏膜波规则，不仅具有精细的三维网状纤维结构，而且成纤维细胞十分活跃，不断产生维持正常黏膜波必须的ECM。在吸烟、滥用嗓音时，声带的修复过程迅速启动，任克氏间隙的上皮及基质细胞处于高活跃状态，ECM产生过多8。任克氏水肿是影响声带任克氏间隙的良性病变，表现为上皮下组织水肿，电镜发现细胞间连接疏松，间隙宽大，尤其在基底层和棘层9 。 2.固有层细胞在LP中，成纤维细胞、肌成纤维细胞和巨噬细胞是重要的细胞。其他细胞在发生生物学里的作用尚为未知。Catten等人指出，大约1/3人群中，中等量的巨噬细胞存在于基底膜区下和SLLP。巨噬细胞对炎症产生应答，也可以导致炎症。多见于声带上皮下，提示这些细胞的存在是为了抵御经上皮细胞来的炎症病原体。成纤维细胞是维持LP结构与功能的细胞，它们降解老化的蛋白质，产生新的蛋白质。它们在声带各层中密度相仿。在婴儿的黄斑中，成纤维细胞已经变成星形细胞并活跃地合成细胞外基质如：网状纤维、胶原纤维、弹性纤维和粘多糖。在成人的黄斑中，成纤维细胞产生纤维只是维持声韧带，而在LP浅层和任克氏间隙中的成纤维细胞似乎不为声韧带产生纤维，而是参与声带损伤时的修复。在成人的黄斑中，成纤维细胞有如下形态学特征：星形，有细长的胞浆突起；核浆比例小，胞浆中存在脂滴和发育良好的内质网：细胞有活性且蛋白合成活跃；PAS强胞浆染色：含多量的糖原和糖蛋白；型胶原（传统称网状纤维，是LP中主要的胶原，在胞外基质中起稳固作用，对维持结构和振动组织的粘弹性是必需的）强胞浆染色；胞外基质的合成活跃10。肌成纤维细胞是已经分化成具有修复作用的成纤维细胞。这些细胞仅仅在发生损伤或破坏，需要修复和重建时才出现。当组织损伤后，这些细胞提供胞外基质修复和重建。令人感兴趣的是：这些细胞被发现于大多数正常人声带中。在SLLP密度最高，随着组织的深度而下降。它们的存在也许表明在正常人声带中一些少量的组织损伤是不断的存在的，这种组织损伤在SLLP最明显11。肌成纤维细胞几乎在声带全层均存在，提示声带会经常出现一些极小的损伤。可以自行有效修复，对声带组织没有任何明显的影响。当损伤更为严重，就会出现不可修复的病理变化。 临床上，大多数声带的微小损伤似乎很快得到自我修复。过度使用声带一个晚上的表演者，通常会在2-3d内声音恢复到正常水平，与基底膜区损伤和修复的研究是一致的。基底膜区在36-48h内完全有能力修复微小损伤。然而，如果每天不断地、有力地损伤声带组织，声带也许就不能很好地自我修复以致发生病理性改变。3.细胞外基质细胞外基质按照组成的分子类型被分成：纤维蛋白、间隙蛋白、其他间隙分子如：碳水化合物及脂质，有关碳水化合物及脂质的作用的研究几乎是空白。纤维蛋白和间隙蛋白已经成为新近研究的热点。两个重要的纤维蛋白，胶原蛋白和弹性蛋白，已经被研究了数十年。间隙蛋白是出现在纤维蛋白之间的蛋白，仅在最近十年里才开始研究。成人声带黏膜固有层的粘弹性直接影响声带黏膜的振动，它依懒于胞外基质：胶原纤维、网状纤维、弹性纤维、糖蛋白和粘多糖（蛋白多糖），其中网状纤维的三维结构在声带黏膜中对于维持结构和振动组织的粘弹性很关键。存在于LP的胶原组织有、型胶原，胶原、主要位于上皮下、内皮下基底膜12。弹性蛋白直接影响声带的振动性质。Gray认为人声带弹力组织有三种类型：分别为：伸展纤维（elaunin）、氧弹纤维（oxytalan）、弹力纤维（elastic fiber）,它们之间的不同是由于组成它们的原纤维及无定形物质的比例不同。其中，弹力纤维最富有弹性，并认为是最成熟的弹力组织。和间隙蛋白的作用不同，胶原蛋白为组织提供力量和结构，当受力时对承受压力和抵抗变形有作用。弹性蛋白赋予组织弹性，具备变形和回复到原有形状的能力，弹力对于声带的恰当的功能来说是有必要的。间隙蛋白影响并经常控制声带的粘滞性。Gray等研究发现透明质酸（hyaluronic acid, HYA）对声带生物力学具有很重要的影响，是影响并控制声带的粘滞性的关键大分子物质。组织中透明质酸浓度越大，粘滞性越高，组织的缓冲能力也越强。下表罗列了一些人类声带中发现的蛋白多糖。表1 人类声带中的蛋白多糖蛋白多糖功能位置透明质酸（Hyaluronic acid）形成和控制组织的粘滞性，影响组织流体阻力和渗透压，提供空间注入和空间占有分子，可能帮助决定LP层的厚度。为LP细胞外基质，在LP的中层略多，多见于LP的巨噬细胞和成纤维细胞中。与性别有关，男性多于女性。核心蛋白多糖(decorin)与胶原纤维结合，延迟纤维蛋白的形成，帮助外伤后降低纤维化和疤痕的形成，可能影响韧带的性能。在固有层细胞外基质中发现，在SLLP中浓度较高。纤维调节素(fibromodulin)使胶原纤维结合延迟和变细。可能影响韧带的性能。在固有层细胞外基质中发现，主要存在于固有层中层和深层，在声韧带周围集聚。乙酰肝素糖蛋白(Heparan sulfate proteglycan)与纤维结合素，IV型胶原和层粘连蛋白（laminin）结合，可能涉及组织的形态发生在声带基底膜区发现，位于固有层的成纤维细胞和巨噬细胞中间隙蛋白和纤维蛋白的分布受年龄和性别的影响，在LP中弹性纤维的密度似乎与年龄相关，与性别关系不大。随年龄增大，弹性纤维的浓度在LP各层中均增高，老年人的弹力纤维浓度比成年人高，SLLP厚度随年纪而变薄，由于胶原纤维的密度在各层相当一致，因此其中的间隙蛋白可能减少。提示在老年人声带SLLP手术瘢痕的形成，并非由细胞外基质的胶原蛋白、弹力蛋白决定，而是蛋白多糖（如透明质酸等）量决定了在SLLP的手术是否产生疤痕13。另一方面，透明质酸、胶原纤维与性别有关而与年龄关系不明显。在细胞水平什么原因使得声带成纤维细胞在声带LP各层表达的基质成分不同，一种可能的解释是与外力对细胞的影响有关，物理作用力也许影响细胞的基因表达，在SLLP和深层受外力大小的不同也许导致了在不同水平的不同基因表达14。纤维粘连蛋白是一种糖蛋白，作为导向胶原沉积的膜板，它在胶原纤维间作为一个纤维间的稳定因子，并作为弹性组织形成的骨架，参与蛋白多糖的聚合。在婴儿期，黄斑中合成的ECM出现在声带的膜部，以启动声带黏膜的三维胞外基质结构的形成，使得声带具备振动特性的粘弹性。在黄斑里合成的网状纤维和胶原纤维向声带膜部延伸，在那里有充裕的纤维粘连蛋白。在婴儿声带RS中的纤维粘连蛋白为网状纤维和胶原纤维的沉积提供骨架，使得纤维蛋白在RS其中沉积，并最终形成声韧带。纤维粘连蛋白随着在RS中纤维成分的增多而减少7。LP的生长发育也引起一些学者的注意，研究表明，新生儿出生及其后很短的时间内，固有层全层仅存在一相对的多细胞单层结构；到2月龄，分化出第一个双层结构，有清楚的细胞群；在11个月龄到5岁期间，可以看到两层清楚的结构：双层结构，固有层存在3层以上的少细胞区域直接与声带肌邻近。7岁时，出现了不同细胞密度，以区分中层和深层。固有层的不同纤维成分（胶原和弹力纤维）直到13岁才出现，在整个青春期都可见到。由此可见，以往依据成人纤维成分和密度来区分固有层，不能很好地说明的固有层的成长发育。一些特殊的区域在出生后2个月就可以发现。应用细胞分布模型并观察其发展或许可以更好地说明固有层的成长过程 15。最近的研究表明，成纤维细胞生长因子可以促进老年小白鼠声带中的成纤维细胞分泌透明质酸，同时减少I型胶原产生，提示成纤维细胞生长因子可能有恢复老年人声带粘弹性的潜在治疗作用16 。4.细胞外基质的调节ECM受成纤维细胞调节。陈旧的或损伤的蛋白被酶破坏或被吞噬，新的分子又从成纤维细胞中产生，这个破坏陈旧蛋白、生产新蛋白的过程被称作ECM周转或调节，它随年龄增长而减慢。纤维蛋白受到成纤维细胞产生的酶调节，这些酶包括：胶原酶，它破坏型和型胶原；白明胶酶，它破坏基底膜胶原蛋白如型胶原；弹性蛋白酶是一种酶解弹性纤维原分子的酶。胶原酶、弹性蛋白酶及白胶原酶被归类为金属蛋白酶。机体也生产金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinase,TIMPS)，它抑制金属蛋白酶活性。在动物模型中，声带中胶原蛋白的产生随年龄的增长显著下降，降解胶原蛋白酶的生产也随年龄明显下降，而TIMPS的产生却没有随年龄而下降，只是在所有年龄组保持在一个相对一致的水平。因此，随着年龄的增长，胶原蛋白的周转明显减慢，以致胶原蛋白在它们被破坏或取代之前变得更老。随着蛋白的老化，一些蛋白出现交叉结合。交叉结合是一种正常情况不会发生的分子间某些部分的生物连接。这些不正常的连接可干扰分子的某些正常生物功能。例如：交叉结合后，弹性蛋白分子弹性变小，胶原分子变得更僵硬。分子越老，出现交叉结合的可能性越大，因而生物性质退化。ECM周转减慢这一事实，从一个方面说明了老年人声带僵硬，音质发生退化的原因。药物治疗也许可以从加快纤维蛋白的周转率入手，提供新鲜的蛋白，使声带更富弹性和更加柔软。晚近的研究描述了家兔模型急性声带损伤后黏膜再生的过程17 。用外科手段使声带受伤后第1天，出现纤维蛋白凝结。第3天大量的细胞渗出，第5天完成上皮覆盖，同时产生新细胞外基质的沉积。第7天出现更多成熟的胶原。伤口愈合的增殖阶段大约出现在伤后的第3天，是对其干预的最佳时间。目前认为透明质酸(HYA)是无瘢痕愈合和维持声带固有层组织粘弹性的关键因素。研究表明，肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、上皮生长因子、碱性生长因子（basic fibroblast growth factor）和转移生长因子b-1（TGF-b-1）都能刺激声带成纤维细胞合成透明质酸，一次调控可以维持合适的HYA水平至少7d18。但伤口瘢痕愈合后固有层不同程度纤维化，恢复声带合适的粘弹性很困难。肝细胞生长因子具有抗纤维化作用，它对声带成纤维细胞的调节作用，已引起学者们的注意。Hirano S19 等人研究认为声带中的HGF由成纤维细胞产生并被释放到上皮与其受体c-Met结合，参与声带损伤的愈合。I型胶原是声带瘢痕的主要成分， 过量的纤维粘连蛋白可以降低声带固有层的粘弹性。任克氏间隙中的成纤维细胞比黄斑中的更易受到HGF的影响，HGF刺激任克氏间隙中的成纤维细胞产生透明质酸， 减少 I 型胶原的产生，而对纤维粘连蛋白的产生没有影响。另一方面，TGF b-1能刺激声带成纤维细胞合成I型胶原、透明质酸、纤维粘连蛋白。对其机理的研究认为，TGF-1通过增加TIMPS的合成，减少金属蛋白酶的分泌，促进ECM的形成并抑制其降解。声带受损时，成纤维细胞产生不同的ECM成分用以修复，同时分泌一些生长因子调控制ECM的合成。TGF-1促进ECM的沉着，而HGF可抑制TGF-1的表达，激活降解ECM成分的酶活性。上述研究表明，HGF对声带瘢痕可能有潜在性治疗和预防作用2021。四.小结黏膜纤毛毯有助于保护声带并通过润滑声带辅助声带振动。上皮特殊的结构同样有利声带的振动，并保护、塑型声带。固有层和细胞外基质是声带的重要部分，它们影响组织的粘滞性和弹性。随年龄的增长，由于减慢了蛋白的周转，细胞外基质遭受了粘滞性和弹性的一些损失。对声带细胞的研究提示在许多正常声带中轻度的炎症是存在的，大多数正常的声带承受频繁的损伤。有多种生长因子通过成纤维细胞而参与了对细胞外基质的调节，HGF被认为对声带瘢痕有治疗或预防作用。细胞健康对声带健康是重要的。因为在声带中细胞的功能知之尚少，所以有待于进一步广泛研究。只有对声带细胞学行为充分理解，临床才能提出一些具体的有意义的治疗方案。参考文献1 Gray SD. 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