yjdhfsouygh oui.doc

第二节 细菌的遗传分析 内容： 一、转化 二、接合一、转化 定义 转化（transformaton）是指某些细菌通过其细胞膜摄取周围供体的染色体片段，并将此外源DNA片段通过重组参入自己的染色体组过程。只有当参入DNA片段产生新的表现型时，才能测知转化的发生。 发现 首先由Griffith（1928）首先在肺炎双球菌中发现，1949年Avery等在分子水平上加以研究，证实了转化因子为DNA。 大部分转化作用是用肺炎双球菌、枯草杆菌和流感嗜血杆菌等完成的。 转化的过程 供体DNA与受体细胞间的最初相互作用 有4个因素影响最初的相互作用 a. 转化片段大小。 肺炎双球菌的成功转化，转化DNA片段至少有800bp，枯草杆菌至少16000bp。 b. 形态。 双链DNA c. 浓度。 对某一个特定的基因来说，供体DNA分子数目与细胞成功的转化之间有一定的相关。一般在转化一定数目DNA之前，两者成正比。如从一个抗链霉素细菌菌株提取DNA转化链霉素敏感的细胞，直到每个细胞含有10个DNA分子之前，抗性转化体的数目一直与DNA分子存在的数目直接成比例。 每个细菌摄取DNA分子数10-12) b. 混合培养A和B菌株。在完全的培养基上培养数小时。 c. 培养物离心，涂布在基本培养基上培养，结果发现长出了一些原养型（met+，bio+，thr+，leu+）的菌落。 疑问 是由于转化还是由于细胞直接接触而发生的遗传物质交换和重组？ U型管实验 1950年Davis设计（如下图） 先在U管底部放入滤片，该滤片可阻止细菌通过，但不影响大分子（DNA）流过。 左管加入A菌株，右管加入B菌株。 左管用棉塞紧，右管加抽进气管。 右管抽进气轮流加压或抽气吸引使左右大分子完全混合。 待两臂细胞在完全培养基中停止生长后，将它们分别涂布在基本培养上，结果都没有出现原养型，说明直接接触是必要条件。 Hayes的试验 Hayes W （1952）实验 A菌株（链霉素处理）B菌株 原养型重组体的数目没有减少 B菌株（链霉素处理）A菌株 没有重组作用发生 说明接合中的遗传物质转移是一种单向过程。 接合的解释（机理） F因子的发现 Hayes和Caraili-sforza（1953）进一步发现：A成为供体，是因为它有一个性因子（sex factor）的致育因子（fertility factor），简称为F因子。 携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F+表示；没有F因子的菌株称为雌性，用F-表示。 F因子结构与特性 结构 大小：环状, 约为细菌组DNA的2%, 94.5kb 。 基因簇: 含有转移、复制和插入等序列 (如下图)。 特性 F因子由DNA组成，是染色体外的遗传物质，能自主繁殖存在，并可以单独存在细胞质中。F因子有三种存在状态： （1）没有F因子，即F-，没有F因子的细胞称为雌性受体F- 。 （2）包含一个自主状态的F因子，即F+，含有F因子的细胞称为雄性供体F+ 。 （3）包含一个整合到自已染色体组内的F因子，即重组型Hfr（ high frequence recombination，高频率重组）。Hfr使两个菌株数杂交后所产生的重组体频率大大增加（1000倍）。 F因子插入不是随机的，而有许多特定的位点（如下图）。F因子整合到染色体上是可逆过程，即F因子可整合到染色体上，也可从染色体上分离下来，在切除分离中往往发生错误，分离出一个携带F因子和部分染色体基因的遗传因子，这种特殊的F因子称为F因子。 F因子的转移（接合）图10-8 F因子的转移有三种方式：一是含有F+因子细菌向不含F+因子的F-细菌转移，即F+F- ；二是 重组型Hfr细菌向F- 细菌转移，即HfrF- ；F 细菌向F- 细菌转移，即FF-。这三种方式的转移过程和特点如下： a、F+F- （a）F+细菌通过纤毛与F-细菌接触并发生相互作用 。 （b）F+细菌出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中。 （c）F因子的一条链一进入F-细菌中，就在F-细菌中复制新的 F因子。 （d）复制完成后， F-细菌变成F+ ，同时原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制，所以转移是 F+的拷贝。 所以最终是F-细菌变成F+细菌，而原有的F+细菌则不变。 b、HfrF- 特点是染色体按定向和均匀速度逐渐进入F-细菌，DNA转移是从oriT起始，F因子的主要部份在 最后进入受体。所以大部分F因子并没有进入受体，中途断开，最终F-细菌没有变成F+细菌。 c、FF- 主要作用是构建稳定的部分二倍体的菌，并能高效表达 。 F+、F和F+Hfr菌的比较 Hfr和F+共同特点： a. 用链霉素处理均不影响与受体杂交。 b. 与受体杂交后,出现的重组体中以大多数非选择性性状是F-受体的遗传性状。 c. 均带有F因子特定表型效应性伞毛。 差异之处： a. HfrF -F+F - (高出1000倍) b. F+F- 。最后是F-F+，但供体染色体基因非常低频率地转移 。 HfrF- 。最后F-还是F- ，但部分染色体高频转移。 c. F菌除了有许多与Hfr和F+相同性质外,最大特点是构建部分二倍体菌。 2. 用中断杂交试验作染色体连锁图 设计人 Jacob和wollman(50年代）根据HfrF-是染色体按定向和均匀逐渐进入F-细菌，大部分F因子并没有进入受体，中途断开的原理，设计中断杂交试验，目的证明接合时遗传物质从供体到受体的转移是直线进行的。 中断杂交试验过程 把Hfr菌株与F-菌株混合培养 Hfr：strsa+b+c+d+ F-：sfrra-b-c-d- 其中str为链霉素，s感 r抗性 a+：叠氨化物抗性基因azir a-：对azrs（敏感） b+：对T1噬菌体抗性tonAr b-：对T1敏感（tonAs） c+：半乳糖（galb+）原养型 c-：半乳糖缺陷型 d+：乳糖（lac+）原养型 d-：乳糖缺陷型 培养一定时间取样，把菌液放在食物搅拌器内搅拌，以中断杂交。 稀释接种到含有链霉素培养基上，杀死Hfr 。 对形成菌进行影印培养测试其基因型，确定a、b、c、d每个基因转移到F-细胞时间。 结果（图10-11） 9min 开始出现少量Na3N抗性，表明azir已进入F- ； 11min 出现T1抗性，表明tonAr已进入； 18min 出现galb原养型，表明galb+已进入； 24min 出现lac 原养型，表明lac+已进入。 分析 Hfr菌株基因是按一定的线性顺序依次进入F-的，也就是说，染色体从原点开始是以直线方式进入F-细胞的（图10-12），离原点愈近，进入愈早，反是则晚。 图10-12 根据中断杂交实验作出的大肠杆菌直线连锁图 单位：分钟，O是原点，F是F因子。 不同Hfr菌株的进一步试验 不同Hfr菌株试验作出基因连锁图，基因顺序不相同，见表10-1。 表10-1 用中断杂交法确定的几个Hfr菌株的基因顺序 从表10-1可以看出，虽然不同，但有规律性，如所有的his基因都有gal在一边，gly在另一边，其他基因也是如此，除非它们连锁群的另一端。其差异是由于转移的原点不同和方向不同所致（图10-13）。进一步说明F因子和细菌染色体都是环状的。Hfr细胞染色体的形成，则因F因子插入环状染色体的不同位置，因而形成了不同的转移原点和转移方向。 3. 大肠杆菌的环状染色体图 如果2个基因间的转移时间2min的间杂交不可靠，应采用传统的重组作图法。 杂交 Hfr lac+ade + F-lac- ade- lac +乳糖不发酵 ade-胸嘌呤缺陷型 用完全培养基但不加膘嘌呤，可选出F-ade+的菌落 由于lac+ ade-近，两者相继进入时间相距很短，难以准确界定，所以只能根据产物确定。 如果选出ade+同时也选出lac+ ，说明lac- ade 间没有发生过交换；如果是lac-说明