蛋白质表达、纯化与晶体结构.doc

中山大学博士学位论文蛋白质表达、纯化与晶体结构姓名:侯静申请学位级别:博士专业:药理学指导教师:颜光美20061201中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构蛋白质表达、纯化与晶体结构专业:药理学姓名:侯静导师:颜光美教授中文摘要第章非出血活性的五步蛇毒锌金属蛋白酶与其内源性三肽抑制剂复合物的晶体结构研究?类蛇毒金属蛋自酶可以直接水解纤维蛋向/纤维蛋白原,因而可作为潜在的溶栓药。但是这类酶同时还可水解血管基底膜蛋白,因此可能导致出血副反应。为了更好地了解来源于五步蛇蛇毒的锌金属蛋白酶的作用机制,为对其进行结构修饰以提高其药理作用的特异性并减少副反应提供结构方面的信息,我们采用汽相扩散悬滴法制备蛋白晶体,并对该晶体进行射线衍射分析,得到了蛋白的. 分辨率的晶体结构,发现一个该酶分子由两个亚结构域组成,并.含两个高度保守的特征性序列:锌结合序列。和?。其中一端结构域占了蛋白全氏的大约/,是一个典型的【邝结构。个螺旋围绕着四个平行的和一个反平行的片层。.端结构域包含了一个长的螺旋。蛋白水解活性必需的锌离子位于两个结构域之间的隙中,并与高度保守序列。中三个组氨酸残基的氮原子和一个水分子螯合。在电子密度图:还清晰地看到在活性中心周围有一个三肽,其序列为?,通过一些实验证实这一三肽对的活性有抑制作用。关键词:蛇毒金属蛋白酶晶体结构三肽抑制剂生些奎堂矍主堂篁迨塞 堡旦里童姿:垫缝量墨堡堕塑一第章蛇毒金属蛋白酶在.的表达尝试的无出血我们实验室在毕赤酵母中成功地表达了来活性的.类重组蛇毒金属蛋白酶,并发现它对大鼠颈动脉血栓动物模型有良好的溶栓作用。但在高剂量时,还可以降解血管基底膜蛋白,因此存在潜在的出血副反应。我竹曾经尝试使用毕赤酵母表达的进行结晶,希望通过晶体结构来解释其作用机理,并利用结构信息来对其进行改造,增加对作用底物的选择性,以减少临床应用的副反应。然而,始终未能得到晶体。推测其原因可能足酵母表达的异源蛋自存在不均一的翻译后修饰所致。大肠杆菌.是目前常用的另个表达异源蛋白的宿主,具有不对所表达的蛋白进行翻译后修饰的优点,迄今为止大部分成功得到晶体结构的重组蛋白都是.表达。因此我们重新将多个片断长度的基因克隆到大肠杆菌表达载体和上,在大肠杆菌菌株、及中过表达。并采用亲和层析、离子交换层析和分子筛层析纯化“可和/或溶性蛋白”,或采用尿素或盐酸胍从包涵体中变性并纯化重组蛋白,采用稀释、亲和柱辅助的手段使变性蛋白复性。未能得到可溶性有活性的蛋白。、关键词:蛇毒金属臻白酶大肠杆菌克隆表达纯化复性第章芳香烃受体核转位因子在大肠杆菌的克隆、表达和纯化?/蛋白超家族. 是在许多重要生理和发育过程基因表达网络中关键的调节因子。被认为是/蛋白家族成员中的通用型配基,主要在中枢神经系统和肾脏表达,可与?位结合形成二聚体,发挥润控缺氧应答的功能。和蛋白形成的二聚体可以调节丘脑神经内分泌轴的发育进程。为了了解在转录,调节方面的分子机制,我们在.克隆、表达和纯化了大鼠?但是未能得到晶体。、关键词: 芳香烃受体核转位因子大肠杆菌克隆表达鳓化中山大学博士学位论文蛋白质表达、纯化与晶体结构第章催化结构域在大肠杆菌的表达、纯化及初步的晶体学研究环核苷酸磷酸二酯酶,可以通过降解环核苷酸,而控制其在细胞内的浓度,从而影响多种生理过程。深入了解对环核苷酸底物特异性和抑制剂选择性的结构基础可以帮助设计效应更强、副作用更少的抑制荆。我们从大肠杆菌菌株表达并纯化了野生把和突变性催化结构域,并得到了未结合配基的、和其水解产物、和非选择性抑制剂复合物以及两个突变体和底物复合物的晶体。希望通过这些晶体的结构信息,更好地了解对底物和抑制剂的识别和作用机制,以帮助设计选择性更高的抑制剂。、关键词:环核:寄酸磷酸二酯酶大肠杆菌表达纯化结晶王中山大学博士学位论文蛋白质表达、纯化与晶体结构,: ? , .,. , ,. ?. . . 】,. / / ?,?.? ? . . . .中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构一 .? .: .一】 ., , ., . . ., , .?.: . , .? /?中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构 . / .一 .,?.,. .: , . . . ,/?. .: 蛋白质表达、纯化与晶体结构中山大学博土学位论文第章非出血活性的五步蛇毒锌金属蛋白酶与其内源性三肽抑制剂复合物的晶体结构研究简 介蛇毒金属蛋白酶,属于锌金属蛋闩酶家族,是来源于毒蛇毒腺的一组依赖锌的蛋白水解酶。根据分子大小和所含结构域的数目,它们通常被分为四类,】:?类,仅含金属蛋白酶结构域;?类,除了含金属蛋白酶结构域外,在一端还有一个去整合素样结构域;?类具有最强的出血活性,是在.类酶的.端又加上一个富含半胱氨酸结构域;.类在?类酶的基础上又加上了一个类凝集素样结构域。近来和更新了最初提出的的分类,包括了些前体分子的分类:?前体,其成熟形式不释放去整合素;?前体,其成熟形式为二聚体;?前体,不含金属蛋白酶结构域:前体,成熟后释放其去整合素和富含半胱氨酸结构域;.前体,成熟后形成二聚体。的主要功能是作为小血因子,在毒蛇捕猎食物刚使猎物死亡。多种血管基底膜蛋白可被降解。这些蛋白包括:,.,; .,。血型胶原和蛋白多糖等.,液凝结蛋白如纤维蛋白原 ,;?因予.,.?.;.也是的水解作用底物。另外,还可抑制血小.,.,并触发细胞因子释放板聚集。这后二个效应和对血管基底膜蛋白的降解作用一起被认为是导致出血活性的主要机制。而埘血液凝结蛋白如纤维蛋白原等的降解加强了其出血作用。尽管多数具有出血活性,有一些主要是.类的在高度纯化后不再有出血活性。对此现象的解释是由】金属蛋白中山大学博士学位论文蛋白质表达、纯化与晶体结构酶对蛋白肽键的水解特异性不同。出血活性的除了可以通过去整合素样/富含半胱氨酸/类凝集素结构域影响血小板聚集和细胞因子释放来促进出血之外,其金属蛋白酶结构域可能对血管基底膜蛋白的特异性更强一些。那些非出血活性的主要属于?类酶,仅含金属蛋白酶结构域,它们可能对纤维蛋白/纤维蛋白原的选择性更强一些。这类酶可以直接作用于纤维蛋白/纤维蛋白原,溶解血栓或阻止血栓形成,因而可作为一种潜在的治疗血管栓塞性疾病的药物。目前临床应用的溶栓药物,如重组组织型纤溶酶原激活剂.,尿激酶和链激酶等纤溶酶原激活剂,。这些溶栓药物通过激活纤溶酶原而发挥溶栓作用,在恢复被阻塞的血管中的血流方面很有效。然而,它们在激活血栓处与纤维蛋白结合的纤溶酶原的同时,也激活了循环中的纤浴酶原,冈此经常会导致系统性纤维蛋白水解和其他凝血蛋白的降解,从而引发出血,。非出血活性的可以直接作用于纤维蛋白/纤维蛋白原,而不用激活纤溶酶原,因而在这一点上优于目前临床应用的溶栓药物。另外,这类由于分子量较小,其免疫原性也较低,而且不会受到血中丝氨酸蛋白酶抑制剂的影响。因此作为溶栓药物具有很好的临床应用前景。目前一种的来源于的纤维蛋白溶解酶已完成了几期临床前及临床试验.,;,;,; .,;.,;.,;/,;,。自?等苒次报道了来源于.的.类 的晶体结构,以来,几个?类的一射线晶体学三维结构也陆续 被报道 .,; .,; .,; .,;.,。阐明这些的结构有助于确定它们的结构一功能关系,从而开发其潜在的药理学用途。毒腺分离纯化了一种我们实验定从来自安徽的五步蛇新的,并命名为 .,。和其它?类比如来源于护的 .,来源于的 .,来源于 的 .,来源 的 .,和来源于中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构的 ,一样,在体外可以直接降解纤维蛋白/纤维蛋白原的一和链 .,并不会影响.,;血浆中组织型纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制物的活性 .,。这些实验结果表明蛇毒金属蛋白酶司能应用于溶栓治疗。为了更好地理解的水解作用机制,我们报道了这个酶的一射线晶体结构。材料和方法.的纯化五步蛇蛇毒冻干粉购自安徽祁门蛇场。从蛇毒冻干粉中分离纯化的工作由梁秀霞等完成,具体步骤参照文献 .,。简.,;而言之,经过次离子交换层析.,.,及次分子筛层析一,后,从蛇毒冻,干粉中得:至 ,经一种改良的纤维蛋白平板技术测得的纤维蛋白溶解活性从离子交换层析后的士/鹇蛋白上升到第二次分子筛层析后的土/皓蛋白。该纯化的蛋白冻于后于一。保存。? 在准备长晶体前,将冻干粉溶解于.,.柱,并用同一缓冲液以./的流速中,上样至洗脱。收集洗脱的第一组分,并浓缩至大约/。.蛋白浓度测定采用 蛋白测定试剂盒,以牛血清白蛋向为标准,按试剂盒说明书测定蛋白浓度。.参照等的方法进行十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳?。.的结晶采用汽相扩散悬滴法 ,新鲜制备的溶液与“池液.,.混合后,划液进行。平衡。第二天晶体开始出现,后体积达到最大,为岬.射线衍射数据收集、处理和结构测定中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构.图像板检测器收集,晶体的射线衍射数据在一台一射线九.由转靶发生器产生,压,电流。晶体在含%油的池液. .,.浸泡数分钟后中后在液氮中快速冷却。所有数据均在收集 。数据的处理和测贯采用程序,。.结构确定和精修:,.,以 采用软件包?,的结构作为模板,用分子置换法进行结构确定。旋转和平移函数的一个解表明在一个不对称单位中仅有一个分子。在平中不一致的残基被替换,并用程序? ,在?年.电子密度图的指引下进行几何结构调整。在经过模拟退火、能量最小化、因子优化和添加水分子等操作对结构进行精修后,在?.内,因子和从.%和.%降到.%和.%。在整个精修过程中,使用基于%反射的计算来监控模型和观察数据之问的一致性。用程序检查修正后结构的立体化学质量 .,。晶体结构的原予坐标己存放于,:/./,编号为。.三肽对的水解活性的抑制冻干粉溶解于蒸馏水中。取此溶液,对蒸馏水透析,然后浓缩至大约】体积。透析和未透析的样品均小一心地用蒸馏水调整到蛋白浓度/反应体系中,含雌,含,不含指定浓度的人工合成三肽上海生工和 ,缓冲液为.。将此反应混合物%混合以终止反应:室温静置后,在孵育,然后,离。于分光光度计.测定卜清在的吸收。此反映了对酪蛋白的水解活性。添加了三肷后的相对酶活性通过与未加三肽的蛋白样品的比较来估算。.堡旦堕鎏:垫丝皇鱼签塑坠虫些盔堂堕主兰堡堡塞 .?十?一一一 石面赢赢?石再面石西.一.。.】.%./.四.仃.%.。.。.?/.% % ,.%。一盂;“蝴:一“,鼍蝴. 雎舭。?:蛐一中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构结果与讨论.由晶体结构推得的氨基酸序列和整体结构纯化后的在?上相对纯度约为%,表观分了量为约。但是根据电子密度图推得的序列仅含个氨基酸残基,其汁算。两个分予量之间的差异可能足由于分子量为. ;电子密度图卜不能看到末端残基所致。和其他?类编号:,含两个高度保守的特征性一样,一个分子由两个亚结构域组成序列:锌结合序列和所谓的 。一端结构域占了蛋白全长的大约/,是一个典型的椰结构。个螺旋围绕着四个平行的和一个反平行的片层。一端结构域从残基?,包含了?和一个长的螺旋。,在其他的结构中也有描述?,;?.,; .,。蛋白水解活性必需的锌离子位于两个结构域之间的间隙中,并与高度保守序列:中三个组氨酸残基的氮原子和一个水分子螫合。在电予密度图上还清晰地看到在活性。中心周围有一个三肽,其序列为?%? ., .中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构.? ?; .一; .? ?尽管多数导致严重出咖.,但是也有缺乏出血活性。这些非出.,。自血活性的要属于?类 .,;被发现以来,寻找与出血活性相灭的分子特征一直是一个重大的挑战。尽管有许多尝试,包括序列比埘,系统发生重建,预期的物理和化学特征的比较及.,;模序搜索 .,;,;.,; .,; .,试图预测潜在的出血活性,但这些尝试都没有得到确定的结果。因此迄今还不是很清楚造成出血月血活性的结构差异。另外,翻译后的糖基化修饰似乎在一些的出血活性中发挥作用,如去掉糖基后的两个出血性,和,不再表现出血活性,但依然能够水解纤维蛋白原和纤粘连蛋白,表明蛋白质分子上糖基的存在町能有助于对底物的特异性识别 .,。但糖基化修饰对其它的出血活性则没有影响,; .,。而 .提出在第个锌结合组氨酸残基中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构和.之间的环区域可能与出血性表性有关,因为这一区域暴露于溶剂中,在各成员问结构的差异很大。同样,依据结构特征,分析解析的和模拟的三维结构,和.?等认为在出血活性潜力和分子表面的极性区域之间存在非直接的关联。我们以前的工作已表明,对大鼠静脉注射,剂量达/,仍不会.,。然而,我们将的氨基酸序列与其引起心脏、肝、肺出血他个非出血活性及个出血活性比较后并没有发现任何特别的残基与出。尽管有个潜在的糖基化位点,但它并血活性有关没有被糖基化修饰。的糖基化状态和分子表面特征是否与其非出血活性有关依然有待于进一步研究来阐明。.活性部位和锌结合环境在锌金属蛋白家族的每个成员的活性中心都有一个水解活性必需的锌离子。到目前为止,已经解出结构的锌金属蛋白分子中的锌离子都被高度保守序列毯中的三个组氨酸残基的氮原子和个或个水分子螯合,如来源于的. :,和来源于晶体中有一个水分子参与对锌离子的螯合,它与锌离子的距离为.。这表明。三个组氨酸残基与锌离子相在分子中锌离子是被螯合形成四面体互作用形成一个三角锥形的形状,第一个结合的组氨酸残基位于顶部,金属离子积其他配基位于形成椎体底面的同一个平面。头两个组氨酸残摹位于一螺旋,最后一个组氨酸残基位于起始于的一个环上。残基的主链二面角,.。,位于目前解出的同类蛋白该位置残基的二面角范围之内.,;,表明这一残基是这一位置必需的。这个环还包含了.这一可能与活性有重大相关意义的模序。因为突变试验表明此模序的突变可造成酶活性下降 .,;,。保守的甲硫氨酸残基的一碳距离与锌离子结合的组氨酸中山大学博士学位论文 蛋白质表达,纯化与晶体结构 .越,直 .,瞄 . .啦, .。.一。.?, 口“,“ .廿,.,二 ?.,四,.? .? : ? ,;,】; .,; . . , ; ,;: ,;.; .,;.,; .,;州“龆燃“船,: .;一.,中山大学博士学位论文蛋白质表达、纯化与晶体结构残基的疏水侧链.,可能在建立一个稳定的环境以固定这些侧链的何置方面有一定作用。活性位点裂隙的上沿由形成,底层哇?所在的环形成。.二硫键一电子密度图显示,在一个分子中有对二硫键,其位置分别为,一乖一。因此按照等的分类,属于三个二硫键的。在这三个二硫键中,位于所有的外侧转折,其周围环境极易受诸如晶体堆积、等的影响,凶此这一。这可以解释为连接的构象在;其它如一之间差异很大什么尽管在和一之间存在高度同源性个残基中%的残基相同,我们使用作为最初的分了置换搜索模板时仍然不能清晰到这个二硫键甚至这个转折的原因。 .“, .三肽抑制物的结合和其对活性的抑制蛇类通过多种方式保护它们自己免受自身毒性成分的影响: 许多金属中蛋白酶以非活性的酶原形式合成并储存在毒腺中,通过一个保守的巯基与活性位点的锌离子结合阻断酶活性;当酶蛋白分子从毒腺中分泌后,蚩白水解移去此巯基,从而使酶原激活为有活性的酶 .,。有的毒蛇血清中含有特殊的糖蛋白,可以与蛇毒出血性蛋白酶形成复合物,.,。 许多蛇毒中含高浓度的从而中和其毒性作用柠檬酸,可通过离子螯合作用抑制酶活性 .,。在蛇毒中中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构存在抑制性肽,保护毒蛇免受其自身毒性蛋白的伤害,并抑制其在毒腺中储存过程中的蛋一水解作用,。当毒液被稀释后,如注入猎物体内时,柠檬酸利肽类抑制物从蛋白酶上解离,从而解除对其活性的抑制作用。 . :; 一 .: 一. ; 一 :., ,.,和其他种类响尾蛇,毒液中分离得到的和,从 和,.,毒液中得到的,.,从毒液中得到的。所有的这些肽在其一端均有个焦谷氨酸残基。来源于 的金属蛋白酶一与三个三肽的复合物的晶体结构以被解出,编号分别为:,:,:,。在晶体结构中,三肽结合在酶的活性中心。这个三肽与先前报道的抑制性三肽很不相同。我们推断这个三肽的功能是的抑制剂,冈为透析后的水解的活性比未透析的高三倍,在透析后的样品中。这一现象表昵是可逆性地与三肽加入抑制了这一活性,这可能结合的。往未透析的样品中加入兰肽也可抑制酶活性中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构是由于纯化过程中蛋白被稀释导致的。然而,在研究所用的浓度范围内,透析/未透析的酶活性均不能被完全抑制。抑制物插入凸出部分和壁形成部分之间,位于个混合的平行/反平行三个一片层之下。从电了密度图上可清晰地看到每个残基,包括?的侧链。. . .抑制剂的.残基结合到位置位由.占据,这与其它报道的三肽该位置的残基不同。由?的、和原子形成的平面堆叠至的咪唑环,其构象与一抑制件三.,。眯唑环与侧链平面之肽的相应位置的残基相似间的平均距离为。,表明这是一个很好的疏水相互作用。另外,从?的.原子到的一原子之间的距离为.,远大于一个理想的氢键健长,但仍然可以共同作用来讲抑制物固定在活性位点。口袋没有完仝被?的侧链占据,另有三个有序的水分子结合到这个口袋中,其情形类似于.,。 被公认为是在含锌蛋白酶的蛋白水解作用中起通用碱的作用 .,。推测这类蛋白酶水解作用的机制是:夹在起催化作用的的羧基和锌离子之间的水分子极性增加。当水分蛋白质表达、纯化与晶体结构中山大学博士学位论文子传递一个氢原子至残基的羧基后,成为亲核试剂攻击底物切割位点的羰基,形成一个锌离子倍配位的中间物。残基的羧基氢传递给切割位点的氮,肽键断裂,释放水解产物。酶分子重新结合一个水分子而再生,&,?,。?的羧基氧原子接近可能的质予供体的的和,其距离分别为.干.。这一现象进一步表明三肽可能是的抑制剂。.抑制剂的.残基结合到位置所示,三肽抑制剂的?残基通过两个氢键与位置结如。合:.的氮原子与的羧摹氧原子形成氢键,键长为.。在其他与抑?的羧基氧原子与的.端氮原子形成氢键,键长.制剂结合的的结构中,在.的侧链和位残基之间还会形成一个额外的氢键。然而,在结构中,位钱基是,因此在该位置不能形成一个相应的氧键。】.;?. “, .中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构.抑制剂的残基这一氨基酸残基与其它报道的三肽抑制剂的相应位置的残基完全不同。在其他与抑制剂结合的的结构中,位残基通常是一个环状的焦性分子,如焦谷氨酸残基。然而,在结,位是个残基。.的羧基氰原子与的一断单原子形成一个氢键,键长为.。这一结合帮助将?稳定在其相应位置。一个额外的水分子通过氢键与.的原予结合;结 论我们报道了非出血性蛇毒锌金属蛋白酶与一种新的内源性三肽复合物的.分辨率的晶体结构。从电子密度图上确定了三肽的氨基酸序列为,并通过一些实验证实这一三肽对的活性有抑制作用。参考文献,.,.,.,. .,牝. ,.,. .,. .,.,. ,?.,.,.,.,. . .,. ,.,.,.,. .,.一., , . ? . ,:.,.,. . 中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构.,.,.,.,.?, ,? .,.,.,., .,. : .,?.,.,.,.,.,.,.,. .: .,?.,.,.,.,.? .,?.,.,.,.,.,. .,?.,.,.,.,.,.,.,.,., ,.,.,.,.?. . .? ,.,. :. ?,.,.,.,., ,. ,.,.,.,?.,?, ,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,中山大学博土学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构,., ., ., .,.,? .,. ?.,?., .,:,.,.,.,.,. ,?.,.,.,.,.,.,., . . ,? : , ,. .,?,.,. :.,./.,.,.,.,.,.,? ,.,.,?.,.,.,.,.,., ?.,. . ,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.?.,.,. :.,?. ,.,.,.: .?.,.,.,.?,.,“,.,., .,.,.中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构.,.,.,.,.,.? ? 一,: ? ? ,.,.?.,.,.,.,.,.,?.?,.,.,.,.,.,.?.,.,.,.,.,. .,. . ,. ,?.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,. .,?. .,., . .,.,.,.,.,.,. :.,?.一 .,. ,.,?,.,.,.中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构,.,.,.,.: .,?.,.,.,.,.,.,. ,. ?, .,.,.,.? ,., ,. ,.,. ,一.,.,.,.,., .,. . .一. .?.?.,.,.,. ?。? . ,?. ., ,. ?. :.,.,. ,?.,.,.,.,?,.,.,., ?. .,. .? ?.,., .,? ? .中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构 , ,.,.,? ,.,.,.,., ? , .,?.?.,.,.,.,., ,? , , ,.,.”.:?., ., .,.,.?.,.,.,.,.,. ?,.,.,.,?. . . ?.?.?,., ,.,.,.,.,., . .?.,.,.,.,., ? .,.,.,.,”,.,.,.,., .,?.,.,.,. ., ,.?.,.,?,.,.中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构.弘.,.,. : .,?.,.,.,.,.,?,.,.,.,. ? ,.,?.,.,.,.,. ,.,.,。,.,.,.,.,.,. ?.,., .,.,. .,?.,.,:.,?.,.,.,.,.,.?,.,.,.,. ,.,.,.,.,?.,.,.,.,., . ?. .,?,.,.,.,., .,., .,? ., ., ., .,.,.,中山大学博士学位论文蛋白质表达、纯化与晶体结构. .,?.,.,.,?,?. .,中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构第章蛇毒金属蛋白酶在.的表达尝试的无出我们实验室在毕赤酵母中成功地表达了来源予活性的.类重组蛇毒金属蛋白酶江伟健等,及, .,并发现它们都对大鼠颈动脉血栓动物模型有良好的溶栓作用。重组蛇毒金属蛋向酶可以特异性地降解纤维蛋白原和纤维蛋白江伟健等,。但在高剂量时,还可以降解血管基底膜蛋白,因此存在潜在的出血副反应汀伟健等,。我们尝试使用毕赤酵母表达的进行结晶,希望通过晶体结构来解释其作用机理,并利用结构信息来对其进行改造,增加对作用底物的选择性,以减少临床应用的副反应。然而,始终未能得到晶体。推测其原因可能足酵母表达的异源蛋白存在不均一的翻译后修饰,所致。大肠杆菌.是目前常用的另一个表达异源蛋白的宿主,具有不埘所表达的蛋白进行翻译后修饰的优点,迄今为卜大部分成功得到晶体结构的重组蛋白都是.表达。因此我们重新尝试在大肠杆菌中表达。第部分蛇毒金属蛋白酶在.的可溶性表达尝试材料和方法.二级结构的预测及引物设计使用二级结构预测软件:/.对准备表达的分子进行二级结构预测 。针对分子全长及另外几个可能增加所表达蛋白水溶性的片段设计引物。引物一览见 。所有正向引物均含酶切位点,反向引物均含 酶切位点。.表达质粒的构建由本实验室邱鹏新等从产自安徽祁门的五步蛇毒腺制备。使用相应引物 扩增 /的编码序列。产物经,双酶切后,分别用 连接酶中山大学博士学位论文蛋白质表达、纯化与晶体结构,连接到经同样酶切的、.和及,质粒载体。这些质粒载体经过改造,多克隆位点含和酶切位点。通过限制性酶切图谱判断目标是否成功插入载体相应位置,并经测序证实插入片断的序列。一.一一? 钢 ?. 姐?汀 ?一 ?.?.?. /一.?.中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构.重组在.的表达中进行过表达。重组质粒转化.菌株或携带重组质粒的.细胞在含扯/氨苄西林,氯霉素.%葡萄糖的培养基中生长至.,然后.异丙基一一硫代一.半乳糖苷?,诱导表达,并在。继续生长小时。一般情况下可从培养基收获约克细胞。.表达的纯化。 /?的分离纯化按裂解液鹰细胞的:将表达了/载体的.细胞悬浮于裂解液中,经 ,裂解细胞。裂解液配方为:,口, 。细胞裂,.,解液经 , .琼脂糖树脂亲和柱/离心,上清上样到, ,.,经 .,一和 .,一冲洗后,重组蛋白用.,一的比例加入牛旺一凝血洗脱。收集洗脱的蛋白,按蛋白溶液/.酶,小时。凝血酶消化后的蛋白溶液上样到.,柱上,用含、和?的., ?,分步洗脱。/?在 时被洗脱,而在 时被洗脱。收集.,洗脱组分,用浓缩装置浓缩后上样到? 柱上,用 ., , , ?洗脱。.的分离纯化按裂解液偿细胞的比例将表达了?的.细胞悬浮于裂解液中,经 ,裂解细胞。裂解液配方为:.,。细胞裂解液经, 离一,上,一,.,清上样到.,亲和柱,经?冲洗后,重组蛋白用.,的比例加一沈脱。收集洗脱的蛋白,按蛋白溶液/.入,过夜。 消化后的蛋白溶液上样到中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构.,柱上,用含、?和 的 分步洗脱。.,?,收集.,洗脱组分,浓缩后上样到?.,柱上,用 , ,.洗脱。.蛋白定量方法根据软件, .,计算的蛋白摩尔消光系数换算,.时相当于蛋白浓度/。.聚丙烯酰胺凝胶电泳参照等的方法进行十二烷基磺酸钠.聚丙烯酰胺凝胶电泳.和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果和讨论.在.表达的重组质粒的构建及表达情况概述的所构建的重组质粒及其在.细胞株或表达情况总结见。在小量表达试验培养基中,除了在.中显而易见表达蛋白主要存在于沉淀中外,相当部分的重组蛋白如/?,?看起来似乎是可溶性表达。因此选用了看起来似乎是可溶性表达的重组质粒进行大量试验。./.的分离纯化载体上含两个,.提供亲和层析位点,硫氧还蛋白,可以帮助外源蛋白在.胞浆中的叮溶性过表达,所表达的.,。携带重组蛋白含一个酶切位点以除去,均可大量表达质粒?的.细胞株及重组融合蛋白/.。该融合蛋白分子量约为,主要存在于细胞裂解。液上清巾中山大学博士学位论文 蛋白质表达、纯化与晶体结构.“/? ? “.厂胁/ .?。,?,? ? ?蛋白质表达、纯化与晶体结构中山大学博士学位论文%. /. .: :? :? ?: : , . .亲和层析含重组融合蛋白?的.细胞裂解液上清上样到?琼脂糖树脂亲和层析柱有相当部分的重组蛋白不能与树脂结合而直接流出,提示可能由于折叠正确导致奉应暴露的一端.被包埋在分子内部。经过.亲和层析,得到了门?。但如 、所示,该重组蛋白从.树脂中洗脱时央带了大量杂蛋白。这一现象即使在纯化的各步缓冲一仍不能得到改善。液中加入%甘油或.%蛋白质表达、纯化与晶体结构中山大学博士学位论文.离子交换层析?琼脂糖树脂初步纯化的?在经一凝血酶消化后,得到的厂】和的。消化反应的混合物上样到强阴离子交换树脂?上后,大于/总量的不能结合到树脂二而直接流出,/存在下被洗脱。然在 存在时被洗脱,另一部份在,。而?结果显示,此组分中仍含大量杂蛋白.分子筛层析从. 组分洗脱的经浓缩后卜样到柱卜进行分子筛层析。结果所有蛋白均在该层析住的空体积 ,。而在此层析条件下,高于及低于分子量的其它杂蛋白仍时流出。未能与分离,而是一起洗脱所有这些现象均表明,所表达的未能确折鸯,在细胞裂解液上清巾是以可溶性聚集体的形式存在。%.分离范围:? 的结果。根据氨基酸序列预测的分子量为,等电更证明了