丹参内生真菌代谢产物抑菌和抗氧化作用的初步探究.doc

项目编号：KFJJ-大学生开放性实验基金项目申 请 书项目名称： 丹参内生真菌代谢产物抑菌和抗氧化作用的初步探究申 请 人： 蒋琳、陈密、程冬梅 所在院系： 陕西师范大学生命科学学院指导教师： 魏希颖联系电话：申报时间： 2008 .07-2009.06一、基本情况项目名称丹参内生真菌代谢产物抑菌和抗氧化作用的初步探究项目来源自拟课题 综合设计 科学研究 计算机应用 人文素质起止时间2008年 7 月 至 2009 年 6 月申请人姓名学院、专业、年级学号项目中的分工联系电话签 名负责人蒋琳 06级生命科学学院生物科学系40608116组织实施实目参加人陈密06级生命科学学院生物科学系40608117抑菌实冬梅06级生命科学学院生物科学系40608131抗氧化实导教师姓名学院职称研究方向联系电话签 名魏希颖生命科学学院副教授应用微生目所依托的实验室微生物学摘要（不超过300字）：对药用植物中的内生真菌进行系统研究，将微生物技术应用于药用植物，可使我们在中药资源保护、中药材产量及中药有效成分含量的提高及新药开发等方面开辟一条新的路径。本实验将选取传统中药丹参为实验材料，采用杯碟法对分离得到的19株丹参内生真菌的次生代谢产物的抑菌能力进行测试；用猪油体系和Fe 诱导发生脂质过氧化，测定终产物丙二醛的含量评价脂质过氧化；DPPH 自由基分析法和NBT还原法测定超氧阴离子自由基活性清除能力评价19株丹参内生真菌的抗氧化能力，为进一步寻找产丹参活性成分内生真菌提供依据，为开发利用天然无害的抗菌和抗氧化药物奠定基础。1、立项依据（研究项目的意义、国内外研究现状、和发展动态）丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）是唇形科（Salvia）鼠尾草属（Lamiaceae）的多年生草本植物，始载于神农本草经，列为上品，以根、茎入药。由于其根肥厚，外面红色且形状似参而得名“丹参”，又称血参、紫丹参、红丹参等。丹参具有祛瘀止痛、活血调经、养心除烦作用，临床主要用于治疗冠心病、心血管病，慢性肝炎、早期肝硬化等疾病。丹参的主要药用成分有脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹参酚酸类。脂溶性丹参酮具有抗菌消炎，调节内分泌的功能。水溶性的丹参酚酸类包括丹酚酸AC(salviano lic acid)A、B、C、迷迭酸(rosm arinic acid) 及其甲酯、丹参素(daiclzein)、原儿茶醛（protocatechuic aldehyde）、原二茶酸（protocatechuic acid）等，此类成份具有抗血小板聚集、抗血栓的形成，改善微循环及抗氧化损伤作用。植物内生真菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织内或细胞间隙,不引起植物产生明显病症的真菌。有关内生真菌的研究始于19世纪末，以后的100多年里，国内外由最初的发现、检测、分类和分离培养，到20世纪80年代后内生真菌对植物有益影响的研究，至现在对其影响机制和群体特征的研究，经历了一个逐步深入的过程。1993年，美国蒙大拿州立大学Stierle从短叶红豆杉的韧皮部分离到一株产新型抗癌物质紫杉醇的内生真菌Taxomyces andreanae ，这引起人们对内生真菌产生抗肿瘤活性物质的极大注意，目前国外从红豆杉及近缘植物分离微生物的工作已陆续有所报道。我国科学工作者也进行了此方面的研究，近年来，从东北红豆杉、三尖杉、南方红豆杉、香榧、云南桃儿七、川八角莲、南方山荷叶中都已经分离出了具有产生抗肿瘤活性物质能力的内生真菌菌株。从目前研究过的植物来看,内生真菌在植物体内是普遍存在的，其种类丰富，数量庞大，而且与其它生物之间有着紧密的生态关系。这些特点使之成为天然活性物质的丰富来源，因而植物内生真菌的代谢产物已经成为国内外研究的热点。植物内生真菌在药用领域的开发和应用越来越被人关注。由于真菌具有易培养、易控制、生产成本低、生长快等优点，并可通过诱变育种等手段来提高菌种性能，所以大规模工业生产容易实现，其应用前景十分广阔，而且对于植物来源的天然药物的新生产途径的开发及濒危药用植物的保护具有十分重要的经济及生态效益。 综上所述，植物的内生菌的研究主要在于内生菌的分离、培养、测定，以及其活性成分的作用，这些研究对内生菌的多样性和潜在价值开发具有重要意义。但是，对于作为常用药用植物丹参内生真菌的研究极其少，丹参内生真菌的代谢产物活性成分的研究至今尚未见报道。本实验将选取丹参为实验材料，对其内生真菌进行分离，并对分离得到的丹参内生真菌次生代谢产物的抑菌能力和抗氧化能力做初步研究，为进一步寻找产丹参活性成分内生真菌提供依据，为开发利用天然无害的抗菌和抗氧化药物奠定基础。二、申请书正文2、项目的主要内容和创新点、拟解决的关键问题项目研究的主要内容：19株丹参内生真菌代谢产物抑制常见细菌的能力，内生真菌代谢产物体外脂质过氧化能力和清除自由基能力测定。创新点：目前对丹参的研究主要集中在化学成份、药理作用的探讨和应用上，还未见有关内生真菌的报道；据文献报道，植物内生真菌一般能够产生与宿主植物相同或相似的生理活性物质。本次实验探究丹参内生真菌代谢产物的抑菌和抗氧化活性，为从分离得到的菌株中寻找产丹参活性物质的丹参内生真菌提供依据。拟解决的关键问题：19株丹参内生真菌代谢产物是否具有抑菌和抗氧化能力 3、研究方案（技术路线）及可行性分析 技术路线：保存内生菌株的活化-摇床培养-离心-上清液和菌体-杯碟法测定抑菌作用； 上清液和菌体-用猪油体系和Fe 诱导发生脂质过氧化，测定终产物丙二醛的含量评价脂质过氧化；根据 Yamaguchi等人提出的DPPH 自由基分析法，测吸光度,计算抑制率，评价清除二苯代苦味酰基自由基的能力；采用氮兰四唑（NBT）还原法测定超氧阴离子自由基活性清除能力评价抗氧化能力。该试验所采用的方法是在查阅大量文献的基础上获得的，技术成熟，方法简单，易于把握，不会出现问题，具有可行性。4、研究计划2008.07-2008.09 抑菌试验2008.10.-2008.12. 质脂过氧化能力测试2009.01. -2009.04. 清除自由基能力测试2009.05.-2009.06. 数据分析整理，书写文章5、成果形式及预期结果:初步获得产丹参活性成分的内生真菌菌株发表学术交流论文1-2篇(核心及以上)经费预算支出类别预算金额（元）主要用途化学试剂1500配置培养基，抑菌测定；配置测试溶液，抗氧化能力测试耗材1000购培养皿，试管，