酵母中还原型谷胱甘肽的提取方法研究.docx

酵母中还原型谷胱甘肽的提取方法研究舒嫒 王家骐 朱立江 黄娟 许铁成(河北梅花味精集团有限公司河北廊坊 065702)摘 要:采用热水和乙醇提取啤酒酵母中的还原型谷胱甘肽(GSH )。研究表明, 在室温条件下, 按菌体与乙醇比例 1: 2(W /V)加入 50%的乙醇, 200rmin- 1, 搅拌 2h, 能有效地提取 GSH , 干酵母谷胱甘肽含量 2.01%。与热水提取法比较, 乙醇提取液量少, 过滤, 浓缩时间短, 所得样品纯度较高, 从而大大减少了 后续纯化的工作量, 并且乙醇可回收重复使用, 因此乙醇提取法是一种有效的提取方法。关键词: 谷胱甘肽; 啤酒酵母; 提取谷胱甘肽(L- - 谷氨酰- L- 半胱氨酰- 甘氨酸)公司); 庚烷磺酸钠(天津傲然精细化工研究所); 牛血清白蛋白(上海蓝季科技有限公司); 考马斯亮 蓝 G- 250(上海蓝季科技有限公司); 还原型谷胱 甘肽标准品 (上海伯奥生物科技有限公司进口分 装); 其余试剂均为分析纯。是三肽化合物,作为机体内重要的生物活性巯基物质, 谷胱甘肽对于维持生物体内合适的氧化还原环境起着至关重要的作用1, 广泛存在于动植 物以及微生物体内, 其中以酵母、谷物种子、胚芽、 人体和动物的心脏、肝脏、肾脏、红细胞和眼睛晶 状体中含量较高2。GSH 的制备方法包括化学法、酶法、发酵, 其 中发酵法是最具潜力的方法3, 4, 5, 由于 GSH 存在 于细胞内, 所以要得到 GSH, 首先必须采用一定 的破壁手段, 使 GSH 溶出。目前关于酵母破壁的 研究较多, 大体可归纳为: 化学破壁 酸解、碱解、1.3仪器LC- 100 高效液相色谱仪(上海伍丰科技仪器有限公司); 752 可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司); LGJ- 12 冷冻干燥机 (北京松源华兴科技 发展有限公司); AL104 电子分析天平 (上海梅特 勒- 托利多仪器有限公司)1.4分析方法物理破壁液体剪切、固体剪切等、生物破壁酶1.4.1啤酒酵母的预处理解、自溶。但是目前的方法尚存在一些问题。如GSH 不稳定, 无法满足食品、医药等领域所要求 的产品纯度高, 采用溶剂无毒等6。用 0.9%生理盐水洗菌体 3 次,得到纯净的啤酒酵母。1.4.2 GSH 抽提方法去除杂质, 以本文以啤酒酵母为研究对象,采用高效液相热水提取 GSH 称取一定量的酵母, 加入水,混匀, 使混合液保持在 95100一段时间后放置 冰水中速冷, 离心, 取上清液。通过测定提取液中GSH 的含量, 计算湿菌体, 于菌体中 GSH 的含量。色谱法检测样品 GSH 纯度, 对热水提取法和酒精提取法提取效果进行比较,条件。从而找出适合的提取乙醇提取 GSH称取一定量的酵母按比例与11.1材料和方法乙醇混合均匀, 室温下搅拌一段时间, 离心, 取上清液。通过测定提取液中 GSH 的含量, 计算湿菌 体, 干菌体中 GSH 的含量。1.4.3 GSH 含量检测方法 亚硝基铁氰化钠法7检测 GSH 含量。 高效液相检测样品中 GSH 纯度8材料啤酒酵母菌种:由上海复旦大学微生物研究室提供。1.2主要试剂亚硝基铁氰化钠(天津科密欧化学试剂有限第 37 卷第 3 期2008 年 7 月发 酵 科技 通 讯DiscoverC18 柱流动所以提取时间确定为 2h。2.1.2 料液比对热水提取 GSH 效果的影响 称取等量酵母分别加入 1, 2, 3, 4, 5, 6 倍体积的沸水混合均匀, 提取 12min 取样检测, 以确定最 佳的提取料液比 2。(250mm4.6mm, 5m);相: 磷酸盐溶液(取磷酸二氢钠 6.80g, 庚烷磺酸钠2.20g, 加水溶解使成 1000ml, 用 磷 酸 调 节 pH 值至 3.0)- 甲醇 (97: 3); 流速: 1ml /min,210nm, 柱温 30, 进样 20l。标品: 称 30mg, 置 100ml 容量瓶。检测波长样品:分别将热水和乙醇提取法提取得到的提取液, 浓缩, 无水乙醇沉淀, 沉淀经真空冷冻干燥 , 为 待 测 样 品 。 称 取 适 量 样 品 ( 约 相 当 于 GSH0.3g), 置 100ml 容量瓶中, 加水稀释, 摇匀, 精 吸取 5ml, 置 50ml 量瓶中, 加水至刻度。蛋白质含量的测定考马斯亮蓝 G- 250 法。结晶牛血清白蛋白, 用 0.15mol /L NaC1 制成lmg /mL 蛋 白 溶 液 , 分 别 吸 取 0.01、0.02、0.03、1.4.4图 2 料液比对热水提取 GS H 的影响0.04、0.05、0.06mL,各 以0.15mol /L NaC1补 至由图 2 可看出, 随着加水量的增加, 浸出的GSH 含量提高, 加水 4 倍体积时, 提取 GSH 含量 达 1.865%, 随加水量的增加, GSH 含量无明显提 高, 考虑到加水量过高会延长上清液浓缩时间, 加 大不必要的工作量, 故加水量选取为 1:4。0.1mL, 然后加入 0.1mg/mL 考马斯亮蓝 G- 250 溶液 5ml, 摇匀, 1h 内以不加试剂为空白, 在 595nm 波长下测吸光度, 制作标准曲线。配 1mg /ml 多糖 样品溶液, 按上述方法操作测吸光度, 以标准曲线 计算样品中蛋白质含量。2.2乙醇提取通过单因素试验发现提取时间, 搅拌速率, 料22.1结果与讨论液比, 乙醇浓度等因素对提取效果有影响。因此在单因素试验的基础上, 以干酵母中 GSH 含量为主 要指标, 选定提取时间, 搅拌速率, 料液比, 乙醇浓 度四因素, 进行 L9(34)正交实验。热水提取2.1.1 提取时间对热水提取 GSH 效果的影响采用热水提取法抽提 GSH, 酵母与 4 倍体积 的沸水混合均匀, 每隔 2min 取样检测, 以确定最 佳的提取时间。表 1乙醇提取 GS H 的因素水平表乙醇浓度表 2正交实验结果图 1 提取时间对热水提取 GS H 的影响由图 1 可以看出, 热水提取 12min 以后, 干酵母中 GSH 含量为 1.905%, 随着浸提时间的延长, GSH 含量随之下降, 这可能是由于在加热的条件 下 GSH 不稳定, 向 GSSH 转化, 造成了部分损失。17实验号ABCD含量(%)111110.43212221.64313331.45421232.01水平因素A提取时间(h)B搅拌速率(rpm)C料液比(g/ml)D(%)112001:130223001:240334001:350发 酵 科技 通 讯第 37 卷提取所得样品谱图中含有许多其他组分, 表明杂质含量较多, 样品 GSH 纯度为 13.56%, 而乙醇提取所得样品谱图中部分组分峰面积减小,甚至已经不存在, 表明杂质含量减少, 样品 GSH 纯度为19.86%。测定结果表明, 乙醇提取法所得样品蛋 白质、核酸、色素等杂质溶出量少, 纯度较高, 从而 减少了后续分离纯化的工作量。由表 2 分析得出,各因素对产物的影响顺序为: CDBA, 即料液比乙醇浓度搅拌速率浸提 时 间 。 乙 醇 提 取 GSH 的 最 佳 工 艺 条 件 为 :A2B1C2D3, 即搅拌速率 200rmin - 1, 提 取 乙 醇 浓 度50%, 料液比 1:2, 浸提时间 2h。图 3GS H 标准色谱图2.3两种提取方法对样品纯度的影响2.3.1两种提取方法样品含量比较表 3两种提取方法比较由于 GSH 分子量很小,在水中的溶解度很大, 扩散要比大分子快得多, 受到的阻力较小, 在细胞不完全破碎的条件下,只要细胞表面产生一图 4热水提取样品色谱图些裂缝, 就可以顺利地扩散到溶剂中, 所以利用一些条件相对温和的方法在提取 GSH 等小分子物 质方面是可行的9。通过比较可以看到, 热水提取 法提取时间短, 方法简便, 由于温度较高, GSH 的 提取率比乙醇提取法稍低, 但是热水提取 GSH 的 同时有大量的蛋白质, 核酸等杂质溶出。试验结果 表明, 乙醇提取法是一种较温和的提取方法, 提取 时间较热水提取时间长, 但料液比例小, 可大大缩短离心, 浓缩提取液的时间,并且乙醇可回收利用, GSH 损失少, 杂质含量较低。2.3.2 HPLC 测定两种提取方法样品纯度由 图 3 可 见 GSH 对 照 品 的 出 峰 时 间 为12.98min。将图 4 与图 5 进行比较可以看出, 热水图 5乙醇提取样品色谱图18方法干酵母 GSH 含 量%蛋白质提 取率%料液比W/V时间 min热水提取1.90539.561:412乙醇提取2.0129.181:2120522311.38623121.04731321.25832231.83933110.98K13.523.692.452.78K24.434.855.484.51K34.063.474.084.89k11.171.230.820.93k21.481.621.831.50k31.351.151.361.63R0.310.471.010.7第 37 卷第 3 期2008 年 7 月发 酵 科技通 讯结论3参考文献:1Penninckx M. A short review on the role of glutathione in the response of yeast to nutritional,environmental,and oxidative stressesJ.Enzyme Microb Technol,2001,26(9- 10):737- 742.2郑建仙, 功能性食品M.北京: 中国轻工业出版社.1995.3林金萍, 李华钟, 李寅等.中国医药工业杂志J.2000, 31(5):236- 239.4周楠迪, 李寅, 陈坚.从酵母细胞中回收谷胱甘肽J.1997, 7 (4): 30- 33.5Kimura Hikari, InoueYoshiharu Kobyashi Susunu: Production of GlutathioneP,Patent of Japan Pn:08- 707884,1996.03.19.6潘飞, 邱雁临, 黄欣.啤酒废酵母中还原型谷胱甘肽的抽提新方法探讨J, 2005, 15(4): 50- 52.7刘娟, 王雅琴, 刘刚 , 张博润. 发酵液中还原型谷胱甘肽三 种测定方法的改进及其比较J.2004, 31(3): 35- 38.8张锦, 邹玉明, 张小松等.反相高效液相色谱法测定还原型 谷胱甘肽制剂的含量J.2005, 14 (12): 41- 41.9范崇东, 王淼, 徐榕榕.热水提取酵母中谷胱甘肽的条件优 化J.2004, 25(2): 132- 135.实验结果表明, 酵母, 加入 4 倍体积的水, 使混合液保持在 95- 100, 12min, 所得 GSH 含量 最高。通过正交实验测定乙醇提取法的最佳工艺条件为: 搅拌速率 200rpm, 提取乙醇浓度 50%, 料 液比 1:2, 浸提时间 2h。用 HPLC 检测两种提取方法所得的样品 GSH 纯度, 从谱图可以看出, 乙醇提取所得样品杂峰相对较少, 纯度达 19.86%, 优 于热水提取法。虽然乙醇提取法较热水提取法提取时间长, 但料液比较小, 可有效地减小下一步过滤, 浓缩的 工作量, 无需加热, 提取 GSH 损失少, 蛋白质、色 素、核酸等杂质溶出少, 所得样品纯度较高, 有益 于后续的分离纯化, 并且乙醇可回收利用, 降低了 成本。实验表明乙醇提取法是一种有效的提取谷 胱甘肽的方法。!培养基灭菌时, 为什么采用高温短时间的方法能减少营养成