实验教材-自编.doc

天然药物化学实验须知建立良好的实验规章制度是保证实验课程教学的重要的环节，尤其进行天然药物化学实验，经常要使用易燃、有毒、有腐蚀性、有刺激性甚至爆炸性的物质以及在加温或减压情况下进行实验操作，为保障实验课程正常开展，防止实验中意外事故的发生，要求学生实验前认真学习实验须知、在思想上要高度重视，严格遵守操作规程，确保实验安全有序的进行。 一、实验室规则1实验前必须充分预习，掌握实验原理和操作程序，做好实验计划。2实验开始前应检查仪器是否完整、装置安装是否正确，合格后方能开始实验；实验过程中不得擅自离开，注意观察实验现象，保证实验正常进行，并及时做好实验记录。3保持实验室内清洁、安静。实验台面要干净整洁，与实验无关的物品不得放在台面上，仪器用后应及时清洗，破损仪器要填写报告单，并注明原因。4实验结束时应搞好各自台面的卫生，关好水电，值日生要负责搞好整个实验室的卫生，关好水、电、门、窗。二、实验室安全规范防火防爆注意事项1倾倒和存放易燃、易挥发性有机溶剂时要远离火源，切勿倒入水池内，必须倒入指定容器内。2不得在烘箱内干燥带有机溶剂的仪器或物品。3存放于冰箱中的有机溶剂必须置于带塞容器内，并应注明标签，定时清扫和检查。乙醚、石油醚等闪燃点低的溶剂不能置冰箱中保存。4使用明火时，实验台面周围不得放置易燃性有机溶剂。5回流或蒸馏易燃性有机溶剂时，不得直火加热，应根据溶剂沸点选用水浴、油浴、沙浴或电热套。注意仪器装置切勿漏气，加入溶剂量不应超量，加热前要加入止爆剂。添加溶剂或补加沸石时必须停止加热，待降温后才能加入，否则会发生爆沸。6乙醚闪燃点低，遇火易引起爆炸，而且在蒸馏过程中，因其本身产生的过氧化物浓度增加易引起爆炸，所以在蒸馏乙醚时不应蒸干。7使用电器设备时应先了解操作规程，不要用湿手触摸电器。8万一不慎引起明火，要保持镇静，立即切断室内所有电源和水源，搬走易燃品，并视着火情况采取不同的灭火措施。防止中毒注意事项：实验室中常用的氯仿、甲醇、苯、卤代甲苯、苯胺、苯酚、二硫化碳、汞、铅等及其化合物，均为有毒或剧毒的药品，中毒途径一般为消化道、呼吸道及皮肤吸收，所以在采用时应注意：1采用毒物要注意，勿洒在容器外边，勿接触皮肤和口腔。2室内应保持良好的通风状况。3产生毒气的操作应在通风橱中进行。4毒物不得随意倾倒，要倒入指定容器统一处理。实验一 虎杖蒽醌类成分的提取、分离和鉴定虎杖是蓼科蓼属植物Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc 的根茎及根，又名阴阳莲。民间用于消炎、杀菌、利尿、通经和镇痛，近年来用于烫伤、止血、消结石和降血脂均有疗效。虎杖根茎中含有较大量的蒽醌类成分和二苯乙烯类成分，后者具降血脂的作用。一、实验目的1学习脂溶性成分和水溶性成分的分离方法。2学习用pH梯度萃取法分离酸性不同的蒽醌类成分。3了解蒽醌类成分的一般性质和鉴别反应。二、实验原理虎杖中的蒽醌成分由于结构中酚羟基数目及位置不同而呈不同强度的酸性。根据此性质，先用乙醚萃取出蒽醌等脂溶性成分，使脂溶性和水溶性成分得到分离，然后再用碱度递增的水溶液（5%NaHCO3，5%Na2CO3，2%NaOH）自乙醚中提出游离蒽醌类成分，达到分离目的。1大黄酸（Rhein）黄色针状结晶，mp321322（升华），不溶于水，能溶于吡啶、碳酸氢钠水溶液、微溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚和石油醚。2大黄素（Emodin）橙黄色长针晶（丙酮中结出者为橙色，甲醇中为黄色）， mp256257能升华，其溶解度如下：Et2O 0.14%，CCl4 0.01%，CH2Cl2 0.0718%，CS2 0.009%，几乎不溶于水，可溶于Na2CO3，NH4OH，NaOH水溶液。3大黄素-6-甲醚(physion)金黄色针晶，熔点207，能升华，溶解性与大黄素类似。4大黄酚（chrysophanol）黄色针晶，易溶于苯、氯仿、乙醚、氢氧化钠水溶液，稍溶于甲醇，难溶于石油醚，不溶于碳酸氢钠和碳酸钠水溶液。易升华。5白黎芦醇葡萄糖苷（polydatin）易溶于甲醇、乙醇、丙酮、热水、可溶于乙酸乙酯，碳酸钠和氢氧化钠水溶液，稍溶于冰水，不溶于乙醚。三、实验流程四、实验方法1乙醇总提取物的制备取虎杖粗粉75克，用95%乙醇回流提取两次，每次用250ml，回流时间分别为1h，0.5h。合并乙醇并浓缩至无醇味。2脂溶性和水溶性成分的分离将总提取物用75ml水溶解,用乙醚萃取三次，用量分别为50ml，25ml，25ml，合并乙醚液为总游离蒽醌乙醚溶液，水层为水溶性成分。3游离蒽醌的分离（1）强酸性成分的分离将上述乙醚液用5%碳酸氢钠水溶液萃取两次（20ml每次），合并碱液，在搅拌下滴加浓盐酸，调节溶液的pH=2，放置，抽滤，水洗沉淀至中性，干燥，得深褐色粉末，为强酸性成分。（2）中等酸性成分的分离将上述5%碳酸氢钠萃取过的乙醚液用5%碳酸钠萃取5次（每次20ml），合并后的碱液同1法处理，所得产品用丙酮重结晶一次，再用甲醇重结晶至薄层色谱检查显单一斑点，测定mp,与文献值对比。（3）弱酸性成分的分离将上述用5%碳酸钠萃取过的乙醚液再用2%氢氧化钠萃取三次（每次15ml），合并后的碱液同1法处理，产品用氯仿甲醇（1：1）重结晶。（4）中性成分上述用氢氧化钠处理过的乙醚液，用水洗至中性，用无水硫酸钠脱水，回收乙醚，残留物用甲醇重结晶。4水溶性成分的分离取2中用乙醚提取过的不溶于乙醚的部分，挥干乙醚，用250ml水热溶，过滤，滤液加活性碳煮沸10分钟，过滤，滤液在蒸发皿中水浴浓缩至510ml，冷却后转移至三角瓶中，加入5ml乙醚，放置，析出物用甲醇重结晶。5鉴定（1）层析法鉴定吸附剂：硅胶CMC板样品： 自制大黄素，大黄素甲醚展开剂：石油醚甲酸乙酯甲酸（15：5：1）显色：（1）在紫外灯下观察荧光（2）浓氨水熏，然后在紫外灯下观察荧光（2）定性反应：分别取大黄素，大黄素甲醚少许，用乙醇溶解，做如下反应：、Borntrger反应：取试液1ml，滴加2%NaOH溶液，观察颜色。、Mg(OAc)2试验：取试液1ml，加入0.5% Mg(OAc)2溶液23滴，观察颜色。五、操作注意事项1. 萃取过程中，容易产生乳化，故应轻轻振摇。2由于乙醚沸点很低，远离火源，打开窗户。3提前烘干所需玻璃仪器。4注意回收乙醇的操作。六、思考题1减压回收较常压回收有哪些优点？影响减压回收速度的关键是什么？如何控制？停止减压蒸馏应如何操作？2pH梯度萃取法的原理是什么？适用于哪些中草药成分的分离？3根据TLC结果，分析各蒽醌类成分的结构与Rf值的关系。4过滤方式有几种？怎样选用？5试总结萃取操作程序及注意事项。实验二 芦丁和槲皮素的提取、分离及鉴定芦丁也称芸香苷，广泛存在于植物界，其中在槐米花中含量较高，可作为提取芦丁的原料。槲皮素即芸香苷苷元，可经芦丁水解制得。槐花米是豆科槐属植物 (Sophora japonica L.) 的花蕾，具有清热、凉血、止血的功效。槐花米的主要成分是芦丁，药理实验证明，其具有调节毛细血管的渗透、抗炎、解痉、抗溃疡、影响脂质代谢及抗菌等作用。一、实验目的1学习黄酮类化合物的提取分离方法。2掌握由黄酮苷水解制取苷元的方法。3了解黄酮类化合物的一般性质及黄酮苷、苷元和糖部分的鉴定方法。 二、实验原理1芦丁（Rutin）淡黄色针晶，熔点188，易溶于热吡啶、热甲醇，热水中溶解度0.55%，冷水中溶解度0.0013%。2槲皮素(Quercetin)黄色结晶，溶于甲醇、乙酸乙酯、吡啶、丙酮、不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚，在乙醇中的溶解度沸时1:23，冷水中1:290。本实验利用芦丁可溶于热水，不溶于冷水的性质进行提取、精制。黄酮苷通过酸水解得到苷元及糖，并可通过TLC、PC进行鉴识。不同黄酮类化合物对紫外光有特定吸收，可利用此对其进行结构测定。三、实验流程四、实验方法1芦丁的提取称取槐花米20克，置烧杯中（1000mL）加热水（50以上）200mL煮沸1520分钟，趁热过滤，滤渣再用150mL热水煮提一次，时间为20分钟，趁热过滤，将上两次的滤液合并，置于烧杯或三角烧瓶中，放置，可析出大量沉淀，等沉淀完全，滤取沉淀，即得芦丁粗品。2芦丁的精制上述沉淀称重后（湿品）加入3040倍量的热水溶解，趁热过滤，放冷析出结晶，过滤，结晶自然干燥（或在红外灯下干燥），得芦丁水精制品。取0.3g水精制品用甲醇重结晶（1:1015）的芦丁精品。3芦丁的水解称取芦丁水精制品0.3克，置于250mL烧杯中，加入30mL2%的硫酸溶解煮沸30分钟（注意观察现象），注意烧杯内液面的位置，保持液面不变。放冷过滤，滤液留作糖的检识，沉淀物为芦丁苷元-槲皮素的粗品，水洗至中性用60%乙醇重结晶，干燥称重，得槲皮素精品。4芦丁的检识（1）糖的检识取芦丁水解后的滤液20mL，加NaHCO3溶液中和至中性（不断搅拌下进行），旋蒸仪浓缩至干，加23mL甲醇溶解，滤去白色的Na2SO4沉淀,滤液作纸层析的样品溶液。层析：纸层析。对照品：鼠李糖，葡萄糖。展开剂：正丁醇：冰乙酸：水（4:1:5）。显色：苯胺-邻苯二甲酸盐试剂，喷后105加热510分钟，显棕色或棕红色斑点。（2）芦丁和槲皮素的纸层析层析：纸层析。对照品：芦丁，槲皮素精品。样品：自制芦丁，槲皮素。展开剂：正丁醇：冰乙酸：水（4:1:5）。显色：可见光下观察，再在紫外光下观察，经氨气熏后再观察。（3）芦丁槲皮素的性质实验：样品制备：取芦丁，槲皮素精品各约10mg（豆粒大）用5ml甲醇溶解定性试验：取上述试液1ml分别置于小试管中，按下列方法进行实验，比较苷元和苷的反应情况。、Molish反应加10%-萘酚溶液1ml，振摇后斜置试管，沿管壁滴加0.5ml浓硫酸。静置观察液面交界处颜色变化。、盐酸-镁粉反应取样品液1ml分别置于两只小试管中，加镁粉约50mg 滴加几滴浓盐酸，观察颜色变化。、Mg(OAc2)纸片反应取两张滤纸条，分别滴2滴芦丁、槲皮素的甲醇溶液，然后各加1%的Mg(OAc) 2甲醇溶液2滴，于紫外灯下观察荧光变化。、AlCl3纸片反应取两张滤纸条，分别滴2滴芦丁，槲皮素的甲醇溶液，然后各加1%的AlCl3乙醇溶液2滴，于紫外灯下观察荧光变化。五、注意事项1芦丁水解时注意保持液面不变（加水补充）。2芦丁水解时注意观察现象。3使用电炉时注远离有机溶剂。4. 甲醇重结晶所需玻器需提前干燥。六、思考题1一般提取液需经适当浓缩，分离纯化才能得到化合物粗品，为什么芦丁不经过这些处理就能得到粗品？2当反应试剂组成是两个以上时，常需考虑实际的加入顺序，试分析盐酸-镁粉反应。3本实验中纸层析的原理是什么？解释化合物结构与Rf值的关系。4黄酮类化合物有哪些提取方法？芦丁的提取还可以用什么方法？5提取总黄酮时为何要将沸水加至槐花米中而不是将槐花米直接加入冷水中逐渐升温加热？6芦丁水解不完全是将产生什么后果？实验三 粉防己生物碱的提取、分离和鉴定粉防己是防己科千金藤属植物粉防己Stephania tetrandra S. Moore的根，又名汉防己、倒地拱、白木香，是一种解热镇痛药。中医用于风湿止痛、利尿消肿以及毒蛇咬伤等。 粉防己的有效成分是生物碱，其总碱含量约为1.2%左右，主要有：汉防己碱（甲素）、防己诺林碱（乙素），二者均属双苯甲基四氢异喹啉类生物碱。临床上用作治疗高血压、神经性疼痛、抗阿米巴原虫，汉防己甲素在动物实验中有抗癌和扩张血管的作用。此外还含有轮环藤酚碱，属原小檗碱型，是水溶性生物碱。一、实验目的1掌握总生物碱的提取以及脂溶性生物碱与水溶性生物碱、脂溶性碱中酚性碱与非酚性碱、水溶性碱与水溶性杂质的分离方法。2学习用吸附柱色谱法分离生物碱。3学习生物碱的各种鉴识方法。4熟练运用各种实验技能，包括重结晶、萃取、薄层色谱和柱色谱等。二、实验原理根据大多数生物碱或生物碱盐能溶于乙醇的通性，用乙醇回流提取法提取总碱，利用季铵碱易溶于水，不溶于亲脂性有机溶剂的性质用溶剂萃取法分离脂溶性生物碱和水溶性生物碱；利用汉防己甲、乙素结构上的差别，用吸附柱色谱分离二者；利用季铵碱可与雷氏盐产生沉淀的性质使其于其他水溶性成分分离。主要生物碱的理化性质：1汉防已甲素（Tetrandrine，汉防已碱，粉防已碱）无色针晶（乙醚），mp 216，有双熔点现象，自丙酮中结晶者，150左右熔后加热又固化，至213复熔，aD21 +241.38（CHCl3， C=0.8）不溶于水和石油醚，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和氯仿等有机溶剂及稀酸水中，可溶于苯。2汉防已乙素（Fangchinoline, 又称防已诺林碱，去甲粉防已碱）无色结晶（氯仿），aD28 +275（CHCl3, C=0.75），溶解行为与汉防已甲素相似，因有一个酚羟基，故极性较汉防已甲素稍高，在苯中的溶解度小于汉防已甲素而在乙醇中又大于汉防已甲素。籍此可以相互分离，用不同溶剂重结晶时，其晶形和溶点不同：乙醇 细棒状结晶 mp 24540甲醇 细棒状结晶 mp 1779丙酮 六面粒状晶 mp 1343轮环藤酚碱（Cylanoline）针状结晶（甲醇、乙醇），mp 2112，aD30 -120（CH3OH, C=0.67），易溶于水、甲醇、乙醇，难溶于苯、乙醚。主要成分的结构式： 三、实验流程四、实验方法1.乙醇总提取物的制备取粗粉100克置于1000毫升圆底烧瓶中，加95%乙醇提取，两次用量分别为250ml、200ml，时间分别为1h、0.5h。每次提取后，过滤；将滤液浓缩至无醇味呈糖浆状物。2亲脂性生物碱和水溶性季胺生物碱的分离把糖浆状总提取物移至500ml烧杯内,逐渐加入1盐酸在搅拌下温热溶解，生物碱成盐溶于水，酸性不溶物下沉，加酸置溶液不再产生沉淀且溶液呈明显的酸性为止，约需150ml。抽滤，沉淀再以少量1盐酸洗两次。合并滤液和洗涤液，用浓氨水调PH至9，这时亲脂性叔胺生物碱游离出来，析出。将此悬浊液转于500ml的分液漏斗中，用70ml氯仿萃取，分出氯仿层，上层浑浊的碱性溶液再用氯仿萃取三次，每次用量40ml至生物碱反应微弱为止，合并氯仿液。氯仿溶液中含亲脂性叔胺生物碱，萃取后剩余的碱液中含有水溶性季胺生物碱。3亲脂性不同的叔胺生物碱的分离纯化将上面所得的氯仿液置于分液漏斗中，用1%NaOH水溶液洗涤两次，每次用碱40ml，弃去碱液，氯仿层再用水洗至中性，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩氯仿溶液，尽量抽干，得到总生物碱。回收氯仿后剩余残渣用丙酮回流溶解（注意回流如仍有粘在瓶壁上的块状残渣要小心刮下并弄碎，再加入适量丙酮溶解），过滤，滤液回收丙酮至适量，放置待晶体析出，抽滤，收集沉淀。母液再经浓缩，又得结晶，合并几次结晶，得汉防己甲素，乙素的混合物。硅胶柱色谱法分离纯化汉防己甲素乙素的混合物(1) 拌样取10mg甲、乙素的混合物，用尽量少的氯仿和甲醇溶解，加入10-20mg的粗硅胶拌匀，水浴挥干溶剂。(2) 湿法装柱硅胶柱采用加压柱，取层析用硅胶H 3g与洗脱剂（氯仿:甲醇25:1）混悬，然后将此混悬液连续倒入色谱柱中，同时打开柱活塞，使洗脱液不断流出（用三角瓶接收），使硅胶自然落下一段距离后，加压，使硅胶面不再下降为止（此过程一定保证硅胶完全浸在洗脱液中）。(3) 洗脱及合并将拌样硅胶上至硅胶柱顶部，用氯仿:甲醇（25:1）作为洗脱剂，开始洗脱，收集多流份（每0.5ml为一份），控制流速2滴/秒，各流份用硅胶薄层检测，合并相同组份，回收溶剂至干，对照标准品鉴定甲乙素。4轮环藤酚碱的分离纯化将氯仿萃取后剩下的碱液用1%的盐酸调至pH34，过滤，然后在水浴上把滤液加热到60C 的饱和雷氏盐水溶液（14%）至不再产生沉淀为止（约3040ml），滤液沉淀、过滤，用少量丙酮洗不溶物，后在丙酮溶液中加100ml丙酮溶解雷氏盐，过滤，用少量丙酮洗不溶物，后在丙酮溶液中加入1%硫酸银溶液至沉淀完全，溶液由红变黄，记录硫酸银溶液的用量。抽滤，去雷氏盐沉淀滤过前，先取少量硅藻土加入水制成糊状，倒入铺好滤纸的布氏漏斗中，制成硅藻土薄饼，以阻止微细的沉淀透过滤纸，用少量水洗涤沉淀。减压回收滤液中的丙酮，放冷，在浓缩液中滴加与硫酸银等当量的10%的氯化钡水溶液至不再产生白色沉淀为，注意不要过量。过滤（方法如上述），去掉生成的硫酸钡沉淀，把滤液转入蒸发皿，在水浴上浓缩至15ml，趁热转移到小三角瓶中，放置，待结晶析出后，抽滤。结晶用热水重结晶，所得精品为轮环藤酚碱盐酸液，测定mp，并进行纸层检识。5鉴定方法（1）叔胺生物碱的薄层色谱吸附剂：硅胶CMC-Na板。样品： 汉防己碱标准品乙醇液； 防己诺林碱标准品乙醇液； 汉防己脂溶性总碱展开剂：氯仿：甲醇（90：10）显色剂：改良的碘化鉍钾溶液（2）定性反应取少量总生物碱溶于稀盐酸中，分置4支试管中，试加入下列试剂13滴，观察现象。苦味酸试剂碘碘化钾试剂硅钨酸试剂碘化鉍钾试剂五、注意事项1.提取总碱时，回收乙醇至稀浸膏即可，过干时，当加入1%HCl液后，会结块而影响提取效果。2.用无水硫酸钠脱水时，要控制其用量，不要超过30g。3.丙酮重结晶时，所用器皿要干燥。六 思考题1为什么有机溶剂必须洗至中性方能浓缩或放置？2何时有机相需要脱水干燥，何时不必？3为什么要用1%氢氧化钠水液洗总提取的氯仿液？附录 常用试剂的配制与应用一、生物碱1改良的碘化铋钾试剂【配制】溶液：0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸及40ml蒸馏水中。溶液：8g碘化钾溶于20ml水中。贮备液：+等体积混合（可在棕色瓶中保存较长时间，并可作沉淀试剂用）喷雾液：1ml贮备液加2ml冰醋酸及10ml蒸馏水混合即得。【应用】取1ml样品的稀酸水液，加入12滴溶液与的等体积混合液，产生桔红色浑浊或沉淀为阳性反应。2碘碘化钾（Wagner）试剂【配制】1g碘及10g碘化钾溶于50ml水中（先溶解碘化钾，后加入碘），加2ml乙酸，再用水稀释至100ml。【应用】取1ml样品的稀酸水液，加入12滴上述试剂，产生棕色或褐色沉淀为阳性反应。3.雷氏铵盐（Ammonium reinechate）试剂【配制】将2g硫氰化铬铵溶于100ml蒸馏水即得。【应用】取1ml样品的稀酸水液（pH56），加入12滴上述试剂产生暗红色沉淀为阳性反应。4硅钨酸试剂【配制】将1g硅钨酸溶于20ml水中，加10%盐酸使成pH2左右。【应用】取1g样品的稀酸水液，加入12滴上述试剂，产生白色至褐色沉淀为阳性反应。5苦味酸试剂【配制】1g苦味酸溶于100ml水中。【应用】取1ml样品的稀酸水液，加入12滴上述试剂，产生黄色沉淀为阳性反应。二、糖1、【配制】萘酚浓硫酸（Molish）试剂溶液：-萘酚1g，加75%乙醇至10ml。溶液：浓硫酸【应用】取1ml样品的稀乙醇或水溶液，加入23滴溶液，混匀，沿试管壁缓缓滴加溶液，静置分层，二液面交界处显紫红色环为阳性反应。2费林试剂【配制】溶液：6.23g结晶硫酸铜溶于100ml水中(不澄清应过滤)。溶液：34.6g酒石酸钾钠及10g氢氧化钠溶于100ml水中(不澄清应过滤)。【应用】取1ml样品的60C水浸液，加入45滴溶液和溶液等体积混合液（临用时配置）。沸水浴上加热数分钟，产生砖红色沉淀为阳性反应。3苯胺邻苯二钾酸试剂【配制】0.93g苯胺入1.66