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RT-PCR简介点击： 2815作者： 来源： 时间： 2007-03-07 本站论坛主要内容RT-PCR原理RT-PCR步骤常见问题分析两步法RT-PCR一步法RT-PCR两步法与一步法RT-PCR比较 RT-PCR主要用途分析基因的转录水平获取目的基因合成cDNA探针逆转录酶的选择AMV：禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42，最新版本可达60 （Bioflux公司）。MMLV：Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最适37，最新版本42 （赛百盛）Super RNaseH- Reverse TranscriptaseMMLV反转录酶的RNase H-突变体，它能将更大部分的RNA转换成cDNA，最适42。（Tiangen天根生化）RNase H的作用水解RNA-DNA杂合链中的RNART-PCR引物的选择随机引物：适用于长的或具有发卡 结构的RNA,特异性最低。起始浓度范围为20l体系50-250g。Oligo(dT15-18)：适用于具有PolyA尾巴的RNA。起始浓度范围为20l体系0.2-0.5g。特异性引物：与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已知的情况。起始浓度范围为20l体系1pmol。提高RT-PCR灵敏度1.分离高质量RNA 2.使用无RNaseH活性的逆转录酶3.提高逆转录酶保温温度 4.减少基因组DNA污染RT常见问题 PCR与RT-PCR技术 点击： 5819 作者： 来源： 日期：2007-03-07 本站论坛 PCR基础 聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表1）。模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。表1. 反应成分 ComponentFinal ConcentrationTemplate104-106 copies of DNA templatePrimer 10.1-0.5MPrimer 20.1-0.5M10X Reaction buffer1XMagnesium1.0-3.0mMdNTP mix200 mM each dNTPThermostable DNA polymerase1-4 units/100 ml reactionRT-PCR基础 RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。 RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A) 选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。图1. RT-PCR概图增加RT-PCR灵敏度 分离高质量RNA 成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍酸性酚的一步法。Trizol试剂法（见下图）将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。TRIzol试剂步骤略图一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A) RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A) RNA，都可以检测到扩增结果（图2）。另外，分离poly(A) RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有mRNA时，poly(A) RNA会增加检测的灵敏度。图2. 总RNA和poly(A) RNA在RT-PCR中的比较以5或1g Hela细胞总RNA（分别为泳道1和2）或500ng和50ng Hela细胞poly(A) RNA（分别为泳道3和4）。使用oligo(dT)引物和SuperScript逆转录酶合成cDNA。扩增对象为DNA聚合酶mRNA 5端377bp片段和复制酶A mRNA的643bp片段，两者都为中等丰度。将1/10的cDNA合成反应产物使用Taq DNA聚合酶扩增30个循环。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000g离心5分钟。 在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。 使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶 逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。 SuperScript逆转录酶，RNaseH- 的MMLV逆转录酶及ThermoScript逆转录酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全长的cDNA（图3）。RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。ThermoScript比AMV的灵敏性强得多（图4）。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力，尤其是克隆较大的cDNA时。同MMLV相比，SuperScrip显著提高了长RT-PCR产物的产量（图5）。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42的温度下进行。 图3 逆转录酶对cDNA第一链产量的影响在建议的合成条件下，使用oligo(dT)引物和10Ci的-PdCTP。第一链的总产量使用TCA沉淀法计算。全长cDNA使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。图4 逆转录酶对RT-PCR灵敏度的影响以oligo(dT)为引物，使用ThermoScript或AMV，在50下由Hela细胞总RNA合成cDNA。使用Platinum Taq DNA聚合酶和人DNA聚合酶引物进行35个循环。图5 逆转录酶对长模板RT-PCR灵敏度的影响人tuberous scherosis mRNA（5.3kb）和人DNA聚合酶mRNA的全长cDNA的合成由SuperScript和MMLV催化。利用oligo(dT)为引物，由5g Hela细胞总RNA合成cDNA。样品使用RNaseH处理，然后使用ELONGASE? Enzyme Mix将1/10的cDNA合成反应产物扩增35个循环。RNaseH产生的障碍RNaseH对第一链cDNA的影响。RNaseH在cDNA合成期间降解RNA:DNA复合体中的RNA。红色箭头代表潜在的酶切位点。提高逆转录保温温度 较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用ThermoScript逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增（图6）。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时（见第三章）。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60前在25保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将RNA/引物混合物从65变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。图6 温度对不同模板的影响使用ThermoScript或AMV，以18S rRNA基因特异性引物，由10ng大豆总RNA在所示温度合成cDNA。将1/10的cDNA反应产物使用高保真Platinum Taq DNA聚合酶进行40个PCR反应循环。表2. 逆转录保温温度 Reverse Transcriptase Incubation TemperatureAMV37C-45CM-MLV37CSuperScriptII RT37C-50CThermoScript RT42C-65CRNA在高于65时开始水解，对于1kb的RNA第一链合成温度可以为70，对于1kb的RNA则需要65。Tth热稳定聚合酶在Mg存在条件下 作为DNA聚合酶，在Mn存在条件下作为RNA聚合酶。它可以在最高65条件下保温。然而，PCR过程中Mn 2+的存在会降低忠实性，这使得Tth聚合酶不太适合用于高精确度的扩增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆转录效率较低，这会降低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和PCR，那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cDNA的扩增产物同污染的基因组DNA的扩增产物区分开来。 促进逆转录的添加剂 包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20的甘油或10的DMSO而不影响SuperScript或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20的甘油而不降低活性。为了在SuperScript逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10的甘油并在45保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4，这不足以抑制PCR。 RNaseH处理 在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosis（图7）。对这种困难模板，RNaseH的处理加强了SuperScript或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。图7 RNaseH处理对RT-PCR的影响使用SuperScript（S）、M-MLV（M）或AMV（A），由5g Hela RNA合成人tuberous sclerosismRNA（5.3kb）的全长cDNA，反应产物的一半使用RnasH处理30分钟，使用ELONGASE Enzyme Mix对相当于起始RNA 0.5的经处理及未处理逆转录产物进行35个循环的扩增。小量RNA检测方法的提高 当仅有小量RNA时，RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无RNase糖元的建议浓度为250g/ml。 在使用SuperScript的逆转录反应中加入乙酰化BSA可以增加灵敏度（图8），而且对于小量RNA，减少SuperScript的量并加入40单位的RnaseOut核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在RNA分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用SuperScript进行逆转录反应时加入BSA或RNase抑制剂。图9 一步法RT-PCR的灵敏度使用SuperScriptOne-Step RT-PCR System从0，0.1，1，10，102，103pg Hela总RNA（分别为泳道1-6）扩增-actin片段。反应在50保温30分钟；942分钟；然后9415秒，5530秒，6890秒进行40个循环；随后在68保温5分钟。反应中包含200 nM正义和反义引物。一步法同两步法RT-PCR的比较 两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点（表3）。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增（图9）。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。表3. 一步法和两步法RT-PCR的比较 两步法步骤一步法步骤起始第一链cDNA合成使用：起始第一链合成使用Oligo(dT)GSP引物随机六聚体GSP引物优点优点灵活方便引物选择扩增酶同逆转录酶预先混合扩增酶的选择转管步骤少，减少污染可能性困难RT-PCR的优化能力高灵敏度同Platinum酶结合提高特异性适用于大量样品分析同Platinum Pfx Taq DNA聚合酶结合提高忠实性适用于定量PCR适用于在单个样品中检测几个mRNA关于扩增酶和产物大小应注意：对于小于4kb的产物使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶对于小于12kb的产物使用Platinum Pfx Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity对于大于12kb的产物使用ELONGAE Enzyme Mix对于一步法RT-PCR，如果产物小于3.5kb，使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶；如果产物小于9kb，使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。增加RT-PCR特异性 第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。 随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20l反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A) RNA。 Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A) RNA大概占总RNA的1%到2，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A) 选择进行优化。建议每20l反应体系使用0.5g oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。 基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行RT-PCR，需要设计多于一个反义引物，因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20l的第一链合成反应体系中使用1pmol反义GSP。 提高逆转录保温温度 为了充分利用GSP特异性的全部优点，应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性。比如，如果一个GSP退火温度为55，那么如果使用AMV或M-MLV在低严谨性的37进行逆转录，GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而SuperScrip和ThermoScript可以在50或更高进行反应，（表2）这就会消除较低温度时产生的非特异性产物（图10）。为获得最大的特异性，可以将RNA/引物混合物直接从65变性温度转移到逆转录保温温度，并加入预热的2反应混合液（cDNA合成热启动）。这有助于防止低温时分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度转换。 图10. 逆转录温度对RT-PCR特异性的影响使用ThermoScript和设计用来同人DNA聚合酶mRNA退火的GSP，由1g Hela RNA合成cDNA。Thermoscript加入到预热的反应混合液中，使用Platinum Taq DNA聚合酶对1/减少基因组DNA污染 RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法，如Trizol Reagent，会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。为了避免产生于基因组DNA的产物，可以在逆转录之前使用扩增级的DNase对RNA进行处理以除去沾染的DNA。将样品在2.0mM EDTA中65保温10分钟以终止DNase消化。EDTA可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖于镁离子的RNA水解。 为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组DNA的产物短。另外对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。增加PCR特异性 引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： *典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 *选择GC含量为40到60或GC含量反映模板GC含量的引物。 *设计5端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 *避免引物对3末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。 *避免3末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。 *避免3末端的错误配对。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 *避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。 有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3端使用简并碱基，因为3端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1M到3M），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。引物退火温度 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55到70。退火温度一般设定比引物的Tm低5。 设定Tm有几种公式。表5列出确定引物Tm最常用的两种方法。第一个公式来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。第二个公式根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。 根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5，以2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。 递减PCR 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1到2，直到退火温度低于Tm 5。只有同同源性最高的目的模板会被扩增。这些产物在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法较为有用，如AFLP DNA指纹分析。 引物浓度 引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5M。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度，可以在260nm（OD260）测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过Beers法则（公式1）计算引物浓度。 微摩消光系数可以使用公式2计算。与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。这是因为引物较短，碱基组成差异很大。在Gibco/BRL定制引物的质检报告中包含了消光系数（OD/mol）和消光系数的倒数（mol/OD）。另外，不要使用寡聚核苷酸作为标准，在EB染色的胶上估算引物浓度，因为引物和标准的染色能力根据序列不同而差异很大。公式2引物纯度和稳定性 定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的（表6）。使用Invitrogen Parallel Array Synthesis技术，不必除盐。同其他方法相比，在Parallel Array Synthesis技术中，通过脱盐而除去的苯甲酰基和异丁酰基很少，因此不会干扰PCR。部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3到5合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。表6. 用于PCR应用的引物最低建议纯度 ApplicationMinimum Suggested PurityPCRStandardFirst-strand cDNA synthesis for RT-PCRStandardAFLP technologyStandardPCR using primers with 5 sequences(restriction endonuclease sites,RNA polymerase promoter sites,etc)CartridgePCR primers 50basesPAGECycle sequencingStandardIsothermal sequencingDesaltedSite-directed mutagenesisCartridgeCFLP techmologyDesalted引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。Invitrogen?以一个最小OD单位确保总寡核苷的产量（表7）。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100M。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。 表7. 各种纯化方法的最低寡核苷酸产量 Minimum Yield(OD) for Different Primer Purities*Number of BasesSynthesis ScaleStandard/DesaltedCartridgeHPLCPAGE大于2050nmole22NANA200nmole88311mol202010310mol200NA10030大于等于2050nmole52NANA200nmole2010311mol502515510mol500NA15050Note:For primers 50 bases, PAGE purification is recommended and HPLC is not an option.NA is not available.*These Yields are seen with the following 5 modifications: biotin, fluorescein(FITC), rhodamine, primary amines(NH2), phosphate(PO4), HEX, TET, FAM, and phosphorothioates(S-Oligos), Other modifications may have slightly lower yields.引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20。以大于10M浓度溶于TE的引物在-20可以稳定保存6个月，但在室温（15到30）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20保存至少1年，在室温（15到30）最多可以保存2个月。 热启动 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。 热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。 Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效（图20）。Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。抗体在PCR配制以及在室温的延时保温过程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在变性步骤的94保温过程中被释放到反应中，恢复了完全的聚合酶活性。同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。使用Platinum Taq DNA聚合酶，在94进行2分钟就可以恢复90的Taq DNA聚合酶活性。 图20. 使用Platinum Taq DNA聚合酶增加特异性A组. 人基因组DNA内克隆的HIV DNA的检测。带有HIV gag区域的1000个质粒DNA拷贝同100ng的基因组DNA混合，使用gag区域的引物进行扩增。泳道1. 使用Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。泳道2. 使用Taq DNA聚合酶，通过在94加入酶而手工热启动。泳道3. 使用Platinum Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。B组. 由100ng人基因组DNA扩增4.1kb的人-球蛋白。泳道1. 使用Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。泳道2. 使用Taq DNA聚合酶，在冰上配制反应液并放置在预热（80）的PCR仪。泳道3. 使用Platinum Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。镁离子浓度 镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200M dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使用Platinum Taq DNA聚合酶。Platinum Taq DNA聚合酶能够在比Taq DNA聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化（图21）。图21. 使用Platinum Taq DNA聚合酶拓宽镁离子浓度范围由100ng人基因组DNA扩增人-球蛋白基因的2.8kb区域。A组，使用Taq DNA聚合酶，在冰上配制反应液并放置在预热（80）的PCR仪。B组，使用Platinum Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。促进PCR的添加剂 退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法（图22）。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。PCRx Solution还有其他优点。在同Platinum Taq DNA聚合酶（图22）和Platinum Pfx DNA聚合酶一起使用时，基本上不需要优化镁离子浓度。这样，将Platinum技术同添加剂结合，增强了特异性，同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度（图23），尤其是会抑制Taq DNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。图22. 使用PCRx Enhancer Solution提高特异性使用Platinum Taq DNA聚合酶，由100ng人基因组DNA扩增一条156bp的片段（GC含量62）。使用标准PCR缓冲液（A组）或带有1PCRx Enhancer Solution的PCRx Amplificaton Buufer（B组），测试不同的MgCl2浓度（泳道1到4分别为1.0，1.5，2.0，2.5mM）。循环在94 30秒，60 30秒，68 1分钟进行35个循环。图23. 测试PCRx Enhancer Solution的不同浓度在带有不同量PCRx Enhancer Solution（0到4）的1PCRx Amplificaton Buufer中，使用Platinum Taq DNA聚合酶，对包含三核苷重复的149bp序列（GC含量78）进行扩增。 Two Step REAL TIME RT-PCR PROTOCOL 点击： 1026 作者： 来源： 日期：2007-03-07 本站论坛 PRIMARY REVIEWER:Erik Snesrud, Jeremy Hasseman1. PURPOSEThis protocol describes how to perform real-time Reverse Transcription PCR in a two stepprocedure (Reverse Transcription being a separate step from the PCR) using SYBR Green as the detected fluorophore and ROX as the passive reference.2. SCOPEThis procedural format is utilized by the Human Colon Cancer and Mouse, Rat, and Arabadopsis microarray projects under the supervision of John Quackenbush and Norman Lee within the Mammalian Genomics Department.3. MATERIALS3.1 TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems; Cat # N808-0234)3.2 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems; Cat # 4309155) OR3.3 QuantiTect SYBR Green PCR Kit (Qiagen; Cat # 204143) (preferred)3.4 RNaseZAP (Ambion; Cat # 9780)3.5 MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate (Applied Biosystems; Cat # N801-0560) OR3.6 Optical 384-well Reaction Plate (Applied Biosystems; Cat # 4309849)3.7 ICycler iQ PCR Plates, 96 well (BioRad; Cat # 2239441) OR3.8 Thin Wall Tubes; 200 ml (BioRad; Cat # 2239473)3.9 Optical Caps (8 Caps/Strip) (Applied Biosystems; Cat # 4323032) OR3.10 Optical Adhesive Covers (Applied Biosystems; Cat # 4311971)3.11 RNAse and DNAse Free WaterNote: Reaction vessels MUST be DNAse and RNAse free.4. PREPARATION4.1 Decontamination4.1.1 The workbench along with the tube racks and pipetmen should all be sprayed down with RNaseZAP (or any RNAse decontaminant) before use.4.1.2 RNases are very difficult to kill and can seriously affect the run.4.2 RNA4.2.1 RNA should be thawed and stored on ice throughout the reverse transcription preparation and frozen immediately after using.4.2.2 Repeated freeze/thaw of RNA samples causes significant degradation in RNA integrity.5. PROCEDURE5.1 Reverse Transcription (RT)5.1.1 Thaw all reagents and store on ice.5.1.2 Maintain an RNAse and DNAse free work environment.5.1.3 Mix all individual reagents thoroughly and spin down.Note: A 100-ml RT reaction efficiently converts a maximum of 2.0 mg total RNA to cDNA. Multiple RT reactions should be performed if more than 2.0 mg total RNA is used.Note: The reverse transcription can be performed using 2 mg in a 100 ml reaction OR using 1 mg in a 50 ml reaction volume.5.1.4 Master mix (for a single 100 ml reaction):Note: As with all enzymatic reactions, mix all nonenzymatic components first and then add the enzymatic components.Note: For the reverse transcription reaction, the final volume does not have to be exact, however for sample comparison, the amount of starting material (added RNA) MUST be equal.5.1.5 Combine all reagents except RNA and mix thoroughly and spin down.5.1.6 Aliquot master mix into either thin wall tubes OR a 96-well reaction plate.Note: The BioRad iCycler iQ PCR plate is designed to be broken into four separate 24-well sections which is useful i