显微摄影(Microphotography).doc

实验八显微摄影（Microphotography）物理学与信息学教研室 庄 晓【实验目的】1. 了解显微摄影的基本原理和三种常见的摄影方法。2. 掌握显微摄影的基本操作技术。3.4. 学习传统的相片冲洗的一般过程。5. 学习利用数码相机拍摄显微数码相片的方法与技巧。【实验仪器】1. XTL 3400型连续变倍体视显微镜一台；2. ZA-1型摄影仪、生物接筒各一台；3. 暗盒每人一个（注：已安装了相纸，不能随意打开）；4. 标本载玻片一片；秒表一只；快门线一条；暗房相片冲洗设备一套；5. Nikon Coolpix 4500型数码相机一台（选做内容）；6. 显微专用连接镜头一个（选做内容）；7. 数码相机电源适配器一个；数码相机USB传输线一条（选做内容）；8. Pentium 计算机；打印机各一台（选做内容）。【实验原理】显微摄影是把显微镜的物镜和目镜所组成的光学成像系统作为照相机的镜头去拍摄一般用肉眼无法看清的标本。这种对微小物体“放大录像”，可直接为教学，科研提供方便。根据显微镜的结构可知：当被观察的标本(AB)放在物镜前焦点稍外一点的位置时，将在目镜前焦点内侧且靠近焦点的位置处形成一个放大倒立的实像(A1B1)，这时再通过目镜（这时的作用象普通放大镜）就可看到一个放大倒立的虚像(A2B2)。如图8-1所示。这就是一般显微镜的成像原理。B2图8-1 显微镜成像系统原理图A2最后的虚像F目镜后焦点标本AB目镜目镜物镜物镜F0A1F0 F B1中间成像AAB如果调节物镜成像的位置(可使标本适当远离物镜或升高目镜，即增大目镜与物镜间的距离，使中间成像介于目镜的一倍焦距与两倍焦距之间)，使物镜所成的像位于目镜前焦点的外侧，此像再经过目镜放大，即可在目镜的另一侧得到一个经二次放大的正立实像，如图8-2所示。当光源足够强时，此像可使底片或相纸感光，或者使数码相机、摄像机的CCD光电元件感光成像，这就是显微摄影的原理。实物标本图8-2 显微摄影成像系统原理图形卡蓝t图A2最后的实像目镜B2目镜物镜物镜F0物镜后焦点2F B1 FA1中间成像F目镜后焦点B F0 A显微镜部分显微摄影仪部分 暗盒将一个特制的摄取影仪装在普通显微镜上方，即可进行显微摄影。其整个实验装置如图8-3所示。由三部分组成 (1)XTL3400型连续变倍体视显微镜；(2)生物接筒；(3)ZA-1显微摄影仪。生物接筒是显微镜和摄影仪的连接装置，内装有目镜(安装接筒时，己将显微镜原目镜拆除)。ZA-1型显微摄影仪为分光棱镜式摄影仪，内有棱镜，经目镜射出的光线，一部分经棱镜透射至摄影仪顶部成像，使感光纸感光，一部分经棱镜反射至观察镜筒的光屏上战像。摄影仪通过精密的光设计，当操作者调节视度调节圈，首先在观察镜筒中看到清晰的“”标记，然后调节显微镜的调焦手轮，使眼睛从摄影仪的目镜中能观察到标本清晰的像，则在顶部暗盒夹处也必成一清晰的像。因此操作者可通过观察镜筒进行观察和取景，调节满意后，就能直接曝光、摄影。摄影仪中还装有快门装置，快门的开、闭由快门线控制。 图8-3显微摄影装置 感光材料：一般为溴化银乳剂，将其涂在胶片上就成为胶卷(底片)，如果将其涂在纸上就成为感光纸，曝光时在光的作用下部分溴化银粒子被还原成金属银而形成潜像，这就是拍照过程。再经过显影液的作用，潜像就变成黑色金属银留在乳剂中，金属银还原的多少即黑度的深浅与曝光时间的长短和光的强弱及波长有关，再经过定影液作用，将未还原的溴化银熔解在定影液中，底片该处就呈透明，这时底片呈现与实物相反的影像，叫做负片。用印相纸复印，就能得到平常所见的照片，(复印是将印相纸的药膜面和底片的药膜面紧贴后曝光，再经显影、定影处理后即得照片)。 目前流行的实用显微摄影的方法主要有三种（注：不包括本实验所用的相纸感光）：第一种方法是利用传统的菲林相机，让被摄物体成像于黑白或彩色胶片上，制成负片，再把它冲印放大成照片（正片），以便观察研究和永久保存。或者让被拍摄物体成像于反转片上，直接制成正片，用于幻灯投影。要求不高时也可直接成像于相纸上，成为一负片，并不影响相片的分辨率。本物理实验室为本、专科学生提供这一显微摄影广方法。第二种方法是利用数码相机，通过专用接筒或外接专用镜头，把被摄物体成像于数码相机的内存中。成为一个压缩的JPEG文件，传输到计算机中，再利用图像显示软件把图像显示于监视器上，或者直接通过打印机输出相片来。也可把图像存贮于媒介上，如软盘、闪存盘、光盘等，再通过数码冲印商店，冲印出数码相片。由于目前市场上大多数数码相机都是不可变换镜头的相机（除了个别昂贵的专用数码相机，如Nikon的1型相机外），所以显微镜不设连接数码相机的卡口，而通过加设一镜头接筒的方法，再连接某些特殊镜头结构的数码相机，如本实验采用的Nikon Coolpix 4500型数码相机。第三种方法，则是在显微镜上加接专用连接镜头，接上CCD摄录镜头，再把动态的图像传送到计算机，通过软件在显示器上表现出动态图像来，可把Video图像存储成某种格式的文件，如avi、mpeg或mov等。也可把瞬间的影像保存到计算机中，成为储存器上的一静态图像的文件，如bmp、tif或jpg等，与数码相机所获得的图像相似。这种方法的优点是能够获得动态图像，在视觉效果上更生动、更胜一筹。不过其静态图像的分辩率一般只能用于电视机或显示器上的显示，并不适合于打印输出和印刷等领域。本实验室目前能提供第一种（加上相纸成像方法）和第二种显微摄影方法。【实验步骤】一 、（方法一之相纸成像）利用ZA-1型摄影仪让标本成像于相纸上，形成一黑白负像。本实验省略胶片拍片过程，直接用放大纸拍成负片。这对分辨生物标本的影像无影响。实验的标本为雄蛔虫横切，标本贴于载玻片上，其大小约为mm2，其实验步骤如下：1 实验室之操作步骤：1) 把生物接筒安装到XTL3400显微镜上，再把ZA-1摄影仪安装到生物接筒上面，然后把两者的螺丝都旋紧，最后插入装有反差适中的2号放大相纸的暗盒。2) 把暗盒上的挡扳抽出到标记横线上。注意：一旦看到标记线，则应立刻停止往外抽挡板，否则挡板可能再也插不进去，相纸报废，实验失败。3) 把载玻片置于XTL3400显微镜的载物台上，并用载物台上的两簧片压紧载玻片，再打开透射灯开关并调节到最大值，打开反射灯开关并调节到中间亮度位置。4) 把ZA-1摄影仪快门上弦，即把扳机片从左向右扳到底一次，扳片自动回复到左边起始位置处。5) 把显微镜的光路控制拉杆压到底，这时从显微镜的左目镜上就能观察到标本的像，以便更好地观察标本，而从摄影仪的目镜上就看不到标本的像。调节聚集旋钮，结合标本在载物台上前后左右移动，可从两目镜上观察到被拍标本清晰的像。如果图像大小不合视场的要求，例如太大或太小，则可调节显微镜的变焦旋钮，使图像在视场中央并大小适中，即可看到标本的全部，各个细节都清晰可见。同时，各部分光线强度比较均匀。6) 把显微镜的光路控制拉杆最大限度地拉出，这时从摄影仪的目镜上就能观察到标本的像，而从显微镜的左目镜则不能。不同的人可能有不同的眼睛焦点，校正摄影仪目镜的视度调节圈，即使标记“”清晰可分，再观察该目镜中标本的成像，如果图像不清，可转动XTL3400显微镜的调焦手轮使其清晰，这时标本就在相纸所在的平面上形成一清晰的像。7) 以上的工作完成后，即可开始摄影。首次操作曝光的同学应预先练习几次，然后才进行真正的拍摄操作。步骤如下：确保秒表已上弦并已回零；左手按下秒表启动按钮，与此同时，确保快门线成一直线并用右手按下其按钮且一直按住不放，听到“嘀嗒”一声响，这时快门开启，开始曝光，秒表指针走到秒处时，松开右手，又听到“嘀嗒”一声响，快门合闭，相纸被曝光秒钟。记下这一时间。8) 小心地把暗盒的挡板推到底，合上暗盒，再把它卸下来，拿到暗房进行冲洗。2 暗房中之操作步骤：1) 暗房中靠墙的平台上设置有若干组相片冲洗设备：各小组分别拥有三个盛有液体的塑料容器及相应的不锈钢夹子，从左到右分别放置的是：D72显影液、清水和定影液，另外，在洗手水槽中盛有大量的清水以供最后清洗相片用。显影液（酸性）与定影液（碱性）会发生化学反应，因此不能够混和，否则它们都会失去药效，影响相片的效果。2) 每组若干位同学到暗房后，应听从暗房老师的指挥。整个显影过程都要在昏暗的红色光线下下进行，只要还要其他同学在进行显影就不能开门，除非暗房中所有同学的相片都完全浸入到定影液中去。闭门熄灯后，暗房中只开着几只小红灯泡照明，在暗房中呆上一两分钟后，人眼即能适应暗房中昏暗的红色光线并看清周围的物体。相纸暴露于该光线下是不会曝光的，因为相纸为红色“色盲片”。相纸反光性较好的一面为药面，即涂有感光材料的正面。3) 确保只有暗红色光线下，抽出你的暗盒上的挡板，取出相纸，用铅笔在你的相纸背面做上记号以免同学之间相片相互混淆。暗盒则交给暗房老师。4) 水洗：用不锈钢夹子夹住相片的一小角，浸入到中间容器的清水中把相纸浸湿，以便在下来的步骤中让显影液和定影液分别与相纸表面有更好的接触，确保相片的显像质量。5) 显影：从清水中取出相纸，浸入到显影液中，用夹子夹住相纸的一角，在显影液中轻轻地晃动以使化学反应更均匀。经过约一两分钟（这个时间根据不同的情况，如显影液的温度、浓度；相纸的曝光程度、新鲜程度等等，可能有变化）后，可观察到相纸上由浅到深逐渐显出影像来，让相片显影到各个细节与层次都清晰可分，稍微黑一些并无大碍，这时候就可把相片从显影液中取出。请注意：在明亮的光线下观察到的正常相片处于昏暗的暗房光线下看上去会更黑一些。这一步骤中要求记下显影时间。6) 水洗：从显影液中取出相片，再浸入到清水中清洗，把显影液清洗干净。7) 定影：把相片浸入到定影液中，定影15分钟。要求记下定影时间。8) 水洗：把定影完毕后的的相片取出，放到洗手槽的清水中，至少清洗15分钟。请记下这一水洗的时间。注：如果条件允许，可让相片在水中至少浸泡一个小时甚至更长时间，彻底地把相片上残留的定影液清洗干净，这对于长时间保存相片是最关键的因素。9) 上光：这是由于本实验所用的相纸是光面纸，需要上光以确保相片表面光亮。把水洗干净后相片滴干水滴，放到上光机洗干净的不锈钢上光板上。多位同学的相片可同时排列于上光板上，然后扣上帆布，接上上光机的电源，再用滚筒在帆布上来回滚动。约15分钟后，打开帆布，如果相片朝上弯曲如炒鱿鱼片般，则上光过程完成。如相片还贴在上光板上，则再扣上帆布继续上光过程。10) 剪裁：用暗房的裁刀把相片剪裁成图像的边与相片的边平行（如果不平行的话），最后用胶水把相片贴到实验报告上。11) 回答实验报告上的问题，再写出你对本实验的感想。 二、（方法一之菲林成像，为选做内容）利用海鸥DF-300E照相机拍摄标本的正片 本实验的标本也为“雄蛔虫横切”载玻片。 （1）把生物接筒安装于XTL3400显微镜上，再安装ZA-1摄影仪的下半部，即露出海鸥DF照相机的接口部分，最后把已安装有胶卷（黑白）的海鸥DF-300E照相机机身安装到摄影仪上。（2）把载波片置于XTL3400显微镜载物台的中央，并用载物台上的簧片压紧玻片，打开透射灯并调节到最大亮度上，打开斜射灯并调节到中等亮度上。（3）把光路控制拉杆压到底，这时从照相机上看不到标本的像，结合标本在载物台上的前后左右移动，可从显微镜两目镜中观察到标本清晰的图像。这时候如果该图像的大小不适合视场的要求，则可调节变焦旋钮，使整个图像显于目镜视场的中央并且大小适中，既可以看到标本的整体，各个细节都清晰可辩，同时光线又比较均匀，便于拍像。（4）把光路控制拉杆最大限度地拉出，这时从显微镜的左目镜中并不能观察到标本的像，只有右目镜能观察到。把海鸥照相机上弦，即把上弦扳机逆时针扳到底，从相机的观察窗中应能观察到标本的清晰图像。把相机的快门速度调节到B门，按下并按住快门释放钮不放，同时按下已上弦的秒表进行计时。10秒钟后放开相机快门按钮，曝光过程结束。记下快门释放时间和胶卷的张数（即海鸥相机的计数器上的数字）。全组同学轮流用同一照相机每人拍下一张像，每位同学拍摄时把海鸥相机上弦一次，并记下自己所拍的像在胶卷中的位置，最后把整卷胶卷都拍完。拍摄完毕后，按下机底部的锁钮，转动相机的暗盒手摇柄，把胶片退回到暗盒内，取出胶卷到暗房内进行冲洗。三、（方法二，为选做内容）利用数码相机拍摄标本的显微数码相片实验步骤：按方法一和二中的做法，放置好标本并调整好XTL3400显微镜，从显微镜中能观察到标本清晰的像。小心地把专用连接镜头旋到Nikon Coolpix 4500型数码相机的摄影镜头上，再把专用连接镜头朝下转接到XTL3400显微镜之