DGGE配制.docx

1个OD值的Oligo DNA/RNA的重量约为33 g，而每个碱基的平均分子量一般按330道尔顿进行计算。因此， 合成DNA/RNA的nmol数一般按以下公式粗略地计算。 如果需要计算合成DNA的精确浓度，请按以下公式进行计算： 如果需要计算合成RNA的精确浓度，请按以下公式进行计算：注：这里的OD值是指DNA/RNA制品的总OD值。引物合成报告单分子量Molecular Weight（MW）分子量MW=碱基个数324.5（每个核苷酸的平均分子量）分子量MW=(A313.21)+( G329.21)+( C289.19)+(T304.20)-61.97注：A、T、G、C分别代表引物中A、T、G、C四种碱基的个数熔解温度Melting Temperature（Tm）是指DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。Tm值与GC含量和碱基数量成正比关系。引物单上会提供一个高盐浓度的Tm值和 一个低盐浓度的Tm值，是公司让我们在摸索自己的体系的Tm值时有一个大概的范围吧。不过不同生物公司计算Tm值得方法都不一样，要做PCR可以按照后一 个，不过最好是按照自己用软件设计的Tm-（5-10度）来进行PCR。当上下游引物Tm值不同时按照低的引物的Tm值设计退火温度。吸光值Optical Density（OD）表示被检测物吸收掉的光密度。由于核酸在260 nm附近有强吸收，因此常根据此性质，用紫外分光光度计测定核酸溶液在260 nm的吸光度值，据此对核酸进行定量，用OD值来表示。1 OD是指：置于光路长度为1 cm的比色皿中的DNA/RNA溶液，如果其在260 nm处的吸光度值为1，则称1 ml该溶液中溶解的DNA/RNA的量为1 OD。1个OD值的合成DNA/RNA的质量约为33 g。n moles per OD表示每个OD值的引物中含有X n moles。用于引物稀释时计算引物的终浓度。引物浓度M（ mol / L）= n / V = mol /L引物浓度M（ mol / L）=（OD值33 g / MW）/L注：V表示加入的无菌TE（pH8.0）或者双蒸水（最好要用调整过pH8.0值的双蒸水）简单的说：若n moles per OD = X，要稀释成10 M 的终浓度，需要加入的TE或者双蒸水的体积为100X（L）。纯化方式Purifaction表示引物的纯化方式。一般的引物的纯化方式有如下几种：C18柱脱盐：又称简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶剂溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段 短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 OPC (Oligonucleotide Purification Cartridge)纯化： OPC纯化是根据DNA保护基（DMT基）和树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。此级别制品可用作 PCR引物、DNA测序引物、各种探针等。该级别只提供长度在35 mer以下的合成DNA制品。序列更长时，制品的纯度得不到保证。PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)纯化：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。 PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于45 mer)的纯化特别有效。如订购的DNA欲用作RT-PCR引物、各种探针，或用于PCR克隆测序、定点突变等，请选用PAGE纯化制品。HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。由于制品纯度非常高，使用本法纯化的DNA制品可适用于各种基 因工程实验。特别是：PCR克隆、定点突变、人工合成基因等。不过，本法只对纯化较短序列 (40 mer)特别有效，合成更长序列 (40 mer)时，PAGE纯化要优于单纯的HPLC纯化。尽管对于较长序列 (40 mer)，PAGE纯化效果要优于HPLC纯化，但如果实验对制品的纯度要求非常高，HPLC与PAGE双重精制会提供更好的制品纯度。该法的弱点是成本 较高，批量生产效率不高。引物的稀释与保存1、引物的稀释一般合成引物总量为2 OD，分装成两管，每管1 OD（一般仅稀释一支，另一支置于-20冰箱备用）（1）12000 rpm 离心3-5分钟。因合成的引物常以干粉的形式提供，真空干燥后呈薄膜状或者粉末状附在离心管中，为了防止开盖时引物干粉散失故稀释前最好离心，使之集中于管底。（2）轻轻打开管盖，加入适量的无菌TE（pH8.0）或者双蒸水（最好要用调整过pH8.0值的双蒸水）稀释至所需浓度。加入的体积参照n moles per OD中的说明。稀释引物，一般先配成储存液（100 M），再吸取一部分配成工作液（10 M），分装成小管。这样的好处是引物不容易降解，引物忌讳反复冻融。（3）振荡后瞬时离心，静置待用2、引物的保存（1）未稀释的引物干粉很稳定，放置于-20可以保存1年。（2）储存液（100 M）放置于-20也可以长期保存.（3）工作液（10 M）短期内经常使用（1-2周），可放置在4下保存，长期保存请放置于-20。（4）荧光标记引物请避光保存。琼脂糖凝胶电泳实验一、实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化 DNA 片段的常用技术。把 DNA 样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于 DNA 分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下， DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不一样，因而可依据 DNA 分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的 DNA ， 也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的 DNA 分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定 DNA 片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭 (ethidium bromide, EB) ，其分子可插入 DNA 的碱基之间，形成一种络合物，在 254 365nm 波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的 DNA 进行检测。一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在 0.2kb 50kb 范围内的 DNA 片段。本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA 片段分离中的应用方法。二、仪器及试剂1. 仪器及耗材 ：水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板或 parafilm 、 100 ml 或 250 ml 锥形瓶、量筒、吸头等。2. 试剂及配制：50TAE 缓冲液的配制： 2 mol/L Tris- 乙酸， 0.05 mol/L EDTA （ pH 8.0 ）配制 1000 mlTris 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入 600 ml 去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至 1 L 后。高温高压灭菌，室温保存。1TAE 缓冲液的配制：称量 20 ml 的 50TAE 缓冲液，再加入 980 ml 的去离子水。溴化乙啶贮存液： 10 mg/ml 溴化乙啶配制： 100 ml称取 1 g 溴化乙啶，置于 100 ml 烧杯中，加入 80 ml 去离子水后搅拌溶解。将溶液定容至 100 ml 后，转移到棕色瓶中。室温保存。6上样缓冲液：0.25% 溴酚蓝， 0.25% 二甲苯青 FF ， 30% 甘油。配制： 10 ml溴酚蓝 25 mg二甲苯青 FF 25 mg甘油 3 ml用 6TAE 缓冲液定溶至 10 ml ，分装成 1 ml/ 管。 -20 保存。其它试剂： DNA 样品、 DNA Ladder 、琼脂糖、三、操作步骤1. 制备 1 琼脂糖凝胶 ( 大胶用 70ml ，小胶用 50ml) ：称取 0.7 g （0.5 g）琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml( 50ml) 1TAE ，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸 3 次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成 1.0% 琼脂糖凝胶液。2. 胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到 65 左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加 1TAE 电泳缓冲液至没过胶板为止。3. 加样：在点样板或 parafilm 上混合 DNA 样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于 1X 。用 10 ul 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压 60 100V ，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约 1cm 处时，停止电泳。5.电泳完毕后，取出凝胶，用含有 0.5 ug/ml 的溴化乙锭 1TAE 溶液染色约 20 min ，再用清水漂洗 10 min 。6. 观察照相：在紫外灯下观察， DNA 存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。四、常见问题及注意事项1 配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。2 琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。3 电泳时应注意电源线路，预防触电。4 溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验室内使用。5 紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。6 DNA 带形状模糊： DNA 加样过多；电压太高；凝胶中有气泡。7 质粒 DNA 的存在形式有 3 种， 共价闭环 DNA （ cccDNA ），常以超螺旋形式存在； 开环 DNA （ ocDNA ），此种质粒 DNA 的两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子； 线状 DNA，因质粒 DNA 的两条链在同一处断裂而造成。因此质粒 DNA 电泳的结果中有可能出现三条泳带，它们的泳动速度为：cccDNA 线状 DNA ocDNA 。DGGE 试剂的配制（1）40%丙烯酰胺/甲叉基双丙烯酰胺溶液（37.5：1）丙烯酰胺 38.93 g甲叉基双丙烯酰胺 1.07 g加ddH2O 至100 ml0.45 µm的滤膜抽滤后避光保存于4。（2）50TAETris base 242.0 gAcetic acid，glacial 57.1 ml0.5 M EDTA，pH 8.0 100.0 mlddH2O 至 1000.0 ml121灭菌30 min，室温保存。（3）10%的过硫酸铵溶液1 g 过硫酸铵溶于10 ml d.d.H2O中，-20保存，一周内有效。（4）8%的丙烯酰胺梯度胶制备试剂 0% 100%40%丙烯酰胺/甲叉基双丙烯酰胺溶液 20 ml 20 ml50TAE buffer（pH=7.4） 2 ml 2 ml去离子甲酰胺 0 40 ml尿素 0 42 gddH2O To 100 ml To 100 ml（5）上样缓冲液甘油 40 mld H2O 10 ml溴酚兰 0.125 g二甲苯青 0.125 g4保存。2.5.2 DGGE 操作（1）将两套玻璃板彻底洗净后60烘干，固定在制胶器上，其下方垫一块密封海绵垫，调整隔条垂直；（2）在冰上分别用100%变性剂溶液和0%变性剂溶液按比例配制45%和70%的胶液各15ml；向两种胶液中分别加入100µl 10%的过硫酸铵溶液，搅匀后再分别加入10µl冰冷的N，N，N，N四甲基乙二胺（TEMED）；（3）用2个30mL 注射器，将上述的两种胶液分别吸入两个注射器，连接好胶管和Y形适配器，排除气体及多余胶，使吸入量各为14.5ml。将注射器固定于梯度混合器上（Model 475 Gradient Delivery System）；（4）匀速地转动推动轮，在810 min完成整个注胶过程，插入具有所需胶孔的的梳子，将梯度胶放于光下聚合；（5）待梯度胶完全聚合后，垂直向上拨去梳子，用1TAE电泳缓冲液通过注射器彻底洗净未完全