L05084朱睿

项目类别项目批准号BL05084附件3 华南农业大学大学生科技创新活动项目结题书项目名称：海藻酸钠壳聚糖固定化木瓜蛋白酶合成镇痛多肽内吗啡肽-1 申 请 人： 朱睿 所在院部： 生命科学学院 专业年级： 02级生物技术1班 联系电话： 38675620 指导教师: 何平 职称 副教授 立项日期： 二五 年 四 月 二十 日 结题日期： 二六 年 四 月 七 日华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心 填 表 说 明 一、 填写结题报告书前，请先咨询指导教师或有关专业教师。申请书的各项内容要求实事求是，逐条认真填写。表达明确、严谨，一律要求用打印稿件。 二 、申请书为A4复印纸，于左侧装订成册。一式三份（至少一份原件），由指导教师和所在院（部）审查并签署意见后报大学生科技创新活动项目指导中心。三 、一级标题三号宋体加粗，用“一、二、三”标示；二级标题四号楷体加粗，用“（一）（二）（三）”标示；三级标题四号仿宋加粗，用“1、2、3”标示；四级标题四号仿宋，用“”标示。示例：一、XXXX课题立项与研究的目的意义（一）XXXX课题立项与研究的目的的意义1、XXXX课题立项与研究的目的意义XXXX课题立项与研究的目的意义四、如表格不够，可以加附页。一、简表项目简况项目名称海藻酸钠壳聚糖固定化木瓜蛋白酶合成镇痛多肽内吗啡肽-1项目类别 B、理科类；申请经费1500元起止年月2005.6-2006.4项目组成员姓 名性别出生年月年级专业班级所在学院上学年综合测评分项目中的分工本人签字朱睿男82.112002生物技术1班生命科学学院总负责人指导教师情况姓名何平性别男学位硕士职称副教授研究方向生物化学授课名称基础生物化学项目简介神经肽在痛觉感受及痛觉调制方面的研究一直是神经科学研究的热点之一。目前，已发现有许多种神经肽在痛觉信息的传递和调制过程中起重要作用，其中最为人们注意的就是内吗啡肽(endomorphin)。内吗啡肽是由美国都蓝大学神经生物学家Zadina等（1997）发现的存在于人体内的一类新的神经肽，共有两种，他们均为四肽结构。第一种是Endomorphixr l (EM-1)，其肽序列为:Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2；第二种是Endomorphixr 2 (EM-2)，其肽序列为:Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2（杨溢秦等，2002）。酶法合成短肽越来越引起人们的重视，并进行了大量研究。利用蛋白酶在有机介质中已合成了若干具有实际应用价值的生物活性小肽，如脑啡肽、甜味剂前体二肽等。个别小肽的酶法合成己达工业生产规模（邢国文等, 1 9 9 8；张学忠，1998；王旭等,1995；Gill et al， 1996；Erbeldinger et al, 1998）。在本研究中，利用IPSAC，以乙腈作为有机介质，探讨Tris-Maleate缓冲液的pH、离子强度、反应温度、反应时间、酶用量等对合成内吗啡肽部分前体Boc-Trp-Phe-NH2二肽的影响和催化内吗啡肽EM-1（Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2）的合成方法。二、项目研究的内容与方法（一）项目研究的基本内容：1. 本试验以IPSAC作为催化剂，以Boc -Trp-OH和Phe-NH2为底物合成Trp-Phe-NH2，用乙腈作为有机介质，探讨Tris-Maleate缓冲液的pH、离子强度、反应温度、反应时间、酶用量等对合成内吗啡肽部分前体Boc-Trp-Phe-NH2二肽的影响和催化内吗啡肽EM-1（Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2）的合成方法。2. 本实验用IPSAC作为催化剂，以Boc-Tyr-Pro-oMe、Trp-Phe-NH2为原料，反应体系以乙腈为有机介质，合成Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2。 （二）实验方法：1海藻酸钠壳聚糖固定化木瓜蛋白酶（immobilized papain on sodium alginate - chitosan ,IPSAC）制备IPSAC制备参考郑婉玲等（1998）所述的方法进行。称取2g海藻酸钠溶于100mL pH 7.2 0.1mol/L Tris-盐酸缓冲液中，再加入1g壳聚糖粉末，微波炉加热至80左右并搅拌均匀,冷却至40左右，加入PA，搅拌。将此混合液缓慢滴入0.5mol/L氯化钙溶液中形成小球，置于冰箱4下30min。使用前用蒸馏水洗涤3次，用粗滤纸吸干。2 Boc-Trp-Phe-NH2二肽的合成方法在100mL具塞三角烧瓶中，加入Tris-Maleate缓冲液（含0.6 mmol/L EDTA）、Boc-Trp-OH（143.5mg）、Phe-NH2 (81.5mg)、IPSAC、75L -巯基乙醇，用乙腈补齐至10mL。水浴恒温振荡后，过滤，得上清液。3 Boc-Trp-Phe-NH2二肽脱Boc基团此实验参考黄惟德等（1985）的方法脱Boc基团。将6.2.4.2所得的上清液减压抽干，加入1mL三氟乙酸，振摇溶解，室温下反应45min。减压抽去三氟乙酸，再溶于2mL 90%（v/v）乙腈溶液中，10000rpm离心10min，得上清液,进行HPLC和质谱分析（分析参数同4）。4 HPLC和质谱分析参数固定相：HYPERSIL ODS 2（250 mm 4.0mm，5um）；流动相：时间在25分钟之内，流速为1mL/min，1（v/v）甲酸所占流动相体积比例为80至60，乙腈所占流动相体积比例为20至40；紫外检测波长为280nm；进样量为10.0ul（进样前将处理好的样品用孔径为0.22um微孔滤膜过滤）。质谱参数：离子源ESI+，加热毛细管温度270，喷雾电压4.5 Kv，鞘气流速80单位，辅助气流速20单位， 加热毛细管电压15V。5 Trp-Phe-NH2二肽合成的动力学在100mL具塞三角烧瓶中，加入0.4 mL 0.4 mol/L pH 6.0的Tris-Maleate缓冲液（含0.6 mmol/L EDTA）、6g IPSAC、75L-巯基乙醇，用乙腈补齐至10mL；另加底物Boc-Trp-OH与Phe-NH2，它们浓度梯度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/L，。30水浴恒温振荡12h后，过滤，得上清液，脱Boc基团（同3），10000r/m离心10min，取上清液进行HPLC分析（分析参数同4）。6 Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2的合成在5mL具塞离心管中，加入120L 0.4 mol/L pH 6.0 Tris-Maleate缓冲液（含0.6 mmol/L EDTA）、Boc-Tyr-Pro-oMe（2.3mg）、Trp-Phe-NH2 (2mg)、1gIPSAC、25L-巯基乙醇，用乙腈补齐至3mL。30水浴恒温振荡12h后，过滤，得上清液，脱Boc基团（同3），10000r/m离心10min，得上清液进行HPLC和质谱分析（分析参数同4）。三、项目研究过程与资料查阅情况（一）项目研究过程与实验结果：1IPSAC催化Trp-Phe-NH2二肽的合成标样的Trp-Phe-NH2 HPLC与质谱图见图6.1；IPSAC催化合成的HPLC与质谱图见图6.2。从HPLC与质谱图可以看出IPSAC成功合成了Trp-Phe-NH2二肽，其分子量为351.1，与标准的分子量一致。图1 Trp-Phe-NH2 标样的HPLC图（左）与质谱图（右）Fig. 1 HPLC(left) and mass spectrum(right) map of the standard sample of Trp-Phe-NH2 图2 IPSAC催化合成的Trp-Phe-NH2 HPLC图（左）与质谱图（右）Fig. 2 HPLC(left) and mass spectrum(right) map of Trp-Phe-NH2 synthesized by IPSAC从表1可以看出pH的R值（R12.9）最大，说明pH对Trp-Phe-NH2的合成影响最大。对Trp-Phe-NH2合成的影响力逐渐递减的因素分别为离子强度（R8.3）、反应时间（R4.7）、溶液含量（R3.6）、反应温度（R3.1）、IPSAC用量（R1.2）。说明IPSAC用量对Trp-Phe-NH2的合成影响最小。通过本试验可知，Trp-Phe-NH2的合成的最佳方案是：乙腈中加入0.4 mL 0.4 mol/L pH 6.0 Tris-Maleate缓冲液，反应温度为30，固定化酶用量为6g，反应时间为12h。以此方案进行实验，得Trp-Phe-NH2 48.7mg，产率为27.8%。表1 IPSAC催化Trp-Phe-NH2二肽合成的正交试验Table 6.1 The reciprocal cross trial of synthesizing Trp-Phe-NH2 by IPSAC瓶号Number Of bottlepH离子强度Ionic strength/(mol/L)溶液含量solution content/%（v/v）反应温度reaction temperature/酶用量enzyme loading /g反应时间reaction time/h产量yield/mg15.40.223031219.925.40.444062421.935.41.065094816.546.00.224064825.956.00.445091243.266.01.063032426.476.60.243092421.086.60.464034825.196.61.025061218.4105.40.265062417.4115.40.423094821.8125.41.044031220.4136.00.245034828.8146.00.463061244.8156.01.024092426.6166.60.264091215.8176.60.425032421.1186.61.043064820.2K1117.9128.8133.7154.1141.7162.5K2195.7177.9155.5135.7148.6134.4K3121.6128.5146.0145.4144.9138.319.721.522.325.723.627.132.629.725.922.624.822.420.321.424.324.224.223.1R12.98.33.63.11.24.72 IPSAC催化合成Trp-Phe-NH2二肽的动力学 IPSAC催化合成Trp-Phe-NH2二肽的动力学见图3。从图中计算出Km为3.17mmol/L，Vmax为3.90mgTrp- Phe-NH2/ mLh。图3 IPSAC合成Trp-Phe-NH2二肽的动力学Fig. 3 The kinetics of IPSAC synthesizing Trp-Phe-NH23 IPSAC催化Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2的合成标样的Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 HPLC与质谱图见图4。IPSAC催化合成的HPLC与质谱图见图5；从HPLC与质谱图可以看出IPSAC成功合成了Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2四肽，其分子量为611.2，与标准分子量一致；得Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 1.23mg，产率为35.2%。图4 Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 标样的HPLC图（左）与质谱图（右）Fig.4 HPLC(left) and mass spectrum(right) map of the standard sample of Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 图5 IPSAC催化合成的Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 的HPLC图（左）与质谱图（右）Fig.5 HPLC(left) and mass spectrum(right) map of Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 synthesized by IPSAC2参考文献Champion H C，Zadina J E，Kastin A J，et alThe endogenous mu7opioid receptor agonists endomorpohin 1and 2 have novel hypotensive activity in the rabbitBiochem Biophys res commun，1997，235(9)：567-570杨溢秦，郭丹，马敏. 内吗啡肽在体内的分布和生理功能. 南京军医学院学报 2002，24（1）：24-26邢国文,叶蕴华,李崇熙.在有机溶剂中进行酶催化合成肽及肽类衍生物的研究进展.高等学校化学学报，1998，19(10): 1602- 1607王旭，张学忠，陈松明等. 在有机介质中用固定化木瓜蛋白酶合成生物活性短肤的研究. 生物化学杂志，1995, 11(5): 622一624Erbeldinger M，Balling P J. Effect of Water and Enzyme Concentration on Thermolysin-Catalyzed Solid-to-Solid Peptide Synthesis. Biotech B ioenA, 1998,59: 68-72郑婉玲，邹云珍，藏向莹.强化海藻酸钠凝胶制备固定化酶.工业微生物，1998，28（3）15-18，23黄惟德，陈常庆. 多肽合成，北京:科学出版社，1985. 47四、项目成果完成形式和价值（一）IPSAC催化Trp-Phe-NH2的合成本试验以IPSAC作为催化剂，以Boc -Trp-OH和Phe-NH2为底物合成Trp-Phe-NH2，用乙腈作为有机介质，加入0.4 mL 0.4 mol/L pH 6.0 Tris-Maleate缓冲液，反应温度为30，IPSAC用量为2g，反应时间为12h；产率为27.8%。从表6.1可以看出pH的R值（R12.9）最大，说明pH对Trp-Phe-NH2的合成影响最大。对Trp-Phe-NH2合成的影响力逐渐递减的因素分别为离子强度（R8.3）、反应时间（R4.7）、溶液含量（R3.6）、反应温度（R3.1）、固定化酶用量（R1.2）。说明IPSAC用量对Boc-Trp-Phe-NH2的合成影响最小。IPSAC催化合成Trp-Phe-NH2二肽的Km为3.17mmol/L，Vmax为3.90mgTrp- Phe-NH2/ mLh。（二） IPSAC催化Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2的合成本实验用IPSAC作为催化剂，以Boc-Tyr-Pro-oMe、Trp-Phe-NH2为原料，反应体系以乙腈为有机介质，合成Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2，合成产率为35.2%。五、经费使用情况学校为本项目资助经费：1500元开支：1、 化学试剂支出：1000元2、 玻璃仪器指出：400元3、 实验用品： 100元合计支出：1500元六、申请人对该项目研究工作完成后的认识总结 通过对该项目的研究探讨后，我们有以下几 点认识总结：1、 前期的准备和精确的操作也是实验中很重要的环节。2、 认识到实验研究是需要持之以恒的决心和严谨细心的态度。3、 在前人的基础上经过充分思考检验才能继续探讨研究。4、 认识到利用固定化木瓜