聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质.doc

实验七 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质一 实验目的掌握聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质。二 实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰化胺凝胶作支持物的一种区带电泳，由于此种凝胶具有分子筛的性质，所以本法对样品的分离作用，不全决定于样品各组分所带净电荷的多少，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度的作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构，很少带有离子的侧基，惰性好，电泳时，电渗作用小，几乎无吸附作用，对热稳定，呈透明状，易于观察结果。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰化胺基侧链的脂肪族大分子化合物。三 实验器材1、血清及其他蛋白质样品。2、移液器。3、稳压直流电源（500V）。4、玻璃管0 .5cm7-10cm(10)。5、灯泡瓶。6、注射器10ml(1)。7、滴管。8、培养皿10cm(5)。9、圆盘电泳槽。10、量瓶25ml（1）、10ml（1）。四 实验试剂1、1mol/LHCL。2、丙烯酰胺（Acr）：3、N，N，N,N-四甲基乙二胺(TEMED):密封避光保存.可用N-二甲氨基丙腈或三乙醇胺代替,但效果较差.4、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis):5、三羧甲基氨基甲烷(简称Tris).6、过硫酸铵(A.R)(聚合用催化剂)7、0.05氨基黑10B溶液:称取50mg溶于100ml水中.8、冰醋酸.9、0.05溴酚蓝溶液:称取50mg溴酚蓝加水溶解并定容到100ml10、40蔗糖。11、20蔗糖-溴酚蓝溶液：100ml20蔗糖溶液加50mg溴酚蓝12、甘氨酸-Tris 缓冲液：称取甘氨酸28.8mg，Tris 0.6g加水定容至1000ml（pH8.3）13、1考马斯亮蓝G250。五 实验方法1、贮备液配置A液小孔胶缓冲液：1mol/LHCL12ml Tris 18.3g TEMED 0.12ml 用稀HCL调PH至8.9，家水至50ml，混浊可过滤。B液大孔胶缓冲液：1mol/LHCL12ml Tris1.5gTEMED0.12ml用稀HCL调PH至6.7加水至25mlC液小孔胶单体溶液：丙烯酰胺g亚甲基双丙烯酰胺0.184用25ml容量瓶容定后过滤.D液大孔胶单体溶液: 丙烯酰胺1g亚甲基双丙烯酰胺0.25g用10ml容量瓶容定后过滤.E液40蔗糖溶液.F液0.14过硫酸铵溶液(要新配,试剂要好)以上试剂需要放入冰箱保存,前四种溶液,配制后如超过两个月需要重新配制.尤其是C,D两液,由于Acr及Tris容易水解生成丙稀酸和NH3,冷藏也只能保存1-2个月.如PH超过5.2,即失效.F液只能使用一个星期.否则,将延缓凝胶聚合.2、准备好内径为0.5cm、cm长的玻璃，切口磨光，洗夜浸泡，洗净烘干备用。3、凝胶的制备：（1）将所用的试剂从冰箱中取出，放至室温（2）小孔胶（分离胶）制备：取一灯泡瓶按V（A）：V（C）：V（水）：V（F）=1：2：1：3的比例混合，混合的溶液抽气（用水泵或油泵，约10min，除溶解氧），然后用滴管将胶加入玻璃管内（玻璃管首先底部贴上胶布，放于有机玻璃试架上，加40蔗糖溶液少许，以使胶面底部平整），当加到玻璃高度2/3时在表面覆盖一层水。25聚合30-60min，使之凝聚。吸取表面水分。（3）大孔胶（浓缩胶）配制：取一灯泡瓶按V（B）：V（D）：V（E）：V（F）=1：1.5：1：4的比例混合，抽气（同上）。加至分离胶面上约1cm高度，表面覆盖一层水，聚合20-30min，除去表面水分。4加样取血清5ul，加于白瓷板凹穴内。用0.1ml20蔗糖溴酚蓝液稀释。取50ul稀释好的样品沿管壁加于大孔胶上，将贴于凝胶管下部的胶布去掉。用甘氨酸-Tris 缓冲液去残留蔗糖液并充以缓冲液（不能有气泡），放入电泳槽缓冲液内。5、电泳将PH8.3甘氨酸-Tris缓冲液倒入电泳槽，阴极在上阳极在下，把玻璃插入电泳槽，上面用少量缓冲液覆盖，每管电流约3mA，开始电压为240V，待溴酚蓝至分离胶时，加大电压360-400V，当溴酚蓝至凝胶下端时，电泳结束（约2-3h）。电泳毕，取下玻璃，用注射器沿玻璃慢慢注入蒸馏水转动360，小心地将凝胶压出（用洗耳球）。电泳时要适当降温，缓冲液先放入冰箱预冷，或电泳槽下放冰。、染色和洗脱将取下的胶条放入%TCA(三绿醋酸)中固定15min左右,用0.05%氨基黑10B染色20min, %醋酸浸泡过夜.如脱色过慢,可于1醋酸中电泳脱色,电压40V,电流50mA,脱色完,可放%醋酸中保存,血清蛋白在凝胶条上可分出十几条带.7、将取下的胶条放入12.5%三绿醋酸中，滴加数滴1%考马斯亮蓝G250水溶液，过夜，%醋酸中保存六 注意事项：1 Acr.和Bis.单体具有神经毒性，并刺激皮肤，应注意防护。2 分离胶聚合时间应控制在30-60min，聚合过快使凝胶太脆易断裂，主要是AP或TEMED过量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是AP或TEMED用量不足或已失效。3 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水，则表示电压或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、凝胶底部断裂等，应注意调整。特别是进入分离胶后应通过控制电压，调节电流不超过5mA/管。4 溴酚蓝在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈黄色，所以固定时间可以以凝胶条上溴酚蓝指示剂蓝色变黄色而定。5 电极缓冲液可重复使用若干次，但上下槽缓冲液不可以混淆，因下槽缓冲液中已混进催化剂及氯离子（快离子），如将它当作上槽液就会影响电泳效果。为节约试剂，