植酸酶的定向改造.doc

植酸酶定向改造研究综述摘要：酶的定向进化是蛋白质工程的新策略，它模拟自然的进化机制，用突变和定向筛选的方法在体外人为改造酶。此文综述了植酸酶定向进化的原理和基本方法，并阐述了研究意义和在实际应用中的研究成果。关键词：植酸酶 定向进化 易错PCR植酸及其盐类是谷物中磷的主要贮藏形式，单胃动物因体内缺乏能分解植酸的酶而难以利用食物中的植酸。植酸酶(肌醇六磷酸酶，Phytase)能将植酸水解为肌醇和磷酸，提高单胃动物对植物性饲料中磷的利用率，降低粪便中磷的含量，还可降低植酸的抗营养作用。目前，植酸酶主要应用于饲料工业，制粒过程需要经过高温加热，致使多数天然酶活力急剧下降，不能满足工业上的需求，限制了植酸酶的进一步推广应用。所以，进一步筛选耐热性好或酶活力高的酶及探索更好的提高酶活力和热稳定性的方法仍是研究的重点。定向进化(directed evolution)是酶分子改造的一种新策略，它主要通过体外模拟自然进化机制，利用基因随机突变、重组和定向筛选技术，使进化过程朝着人们需要的方向发展。植酸酶定向进化的方法和策略1.1 制造植酸酶基因突变体 对于定向进化，关键步骤是创造基因的多样性。其主要是利用易错PcR1.1.1 易错PCR（errorr prone PCR）是一种利用PCR技术在DNA序列中随机制造突变的方法，其基本原理是通过改变正常PCR反应体系中某些组分的数量或质量，随机引入错误的碱基从而创造序列多样性的DNA序列文库。利用易错PCR技术对黑曲霉(AspergiUus niger)N25的植酸酶基因phyA进行定向进化研究，突变基因产物重组于表达栽体pET32a(+)中，并导入大肠杆茵B121(DE3)构建突变体文库。1.1.2 盒式PCR诱变(PCR cassette mutaegnesis) 盒式PCR诱变可以在特定的区域引入突变，有一定的目的性。其基本原理是使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物,启动单链DNA分子进行复制,随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分,因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列。将待突变的植酸酶基因插入M13噬菌体载体,制备单链DNA将化学合成的寡核苷酸片段与单链模板退火,在DNA聚合酶作用下合成互补的双链DNA将双链DNA转化大肠杆菌,获得植酸酶的突变基因。1.2 植酸酶的表达、筛选和酶活测定植酸酶基因突变体库的高通量筛选采用试管筛选法。接种以上获得的所有克隆子到装有2 mL LB-AMP培养基的10 mL试管中，37培养12 h，以2的接种量接种到装有3 mL LBAMP培养基中继续培养3 h后加入终浓度为1 mmoLL的IPTG，诱导培养4 h。取1 mL诱导液4条件下4 000 rmin离心10 min，弃去上清。细胞裂解采用溶菌酶法，酶活性测定在酶标板上进行，用钒钼磷法测定植酸酶的活力。取50L裂解液于酶标板中，加入100L植酸钠溶液，于37水浴30 min后，加入100L颜色终止液，对照组先加颜色终止液后加植酸钠溶液，静止10 min后测定酶活。设立pET-phyA和pET32a(+)空载体对照。1.3 植酸酶基因的诱导表达将重组大肠杆菌pET32a-phyA和筛选获得的有益突变株接入LBAMP培养基中，37培养12h，以2%接种量接种到20mL新鲜的LB-AMP培养基中继续培养3h后加入终浓度为1mmoL/L的IPTG诱导培养4h，离心，弃上清。1.4 表达产物的分析和鉴定 对诱导前和诱导后菌体沉淀进行SDSPAGE分析检测重组蛋白的表达情况。细胞裂解采用溶菌酶法，并对裂解液进行酶活性测定。SDSPAGE电泳检测参照Invitrogen公司操作手册。植酸酶活性单位定义为在37、pH45的条件下，1 min从0005mol的植酸钠溶液中稀释放出1 nmol无机磷所需要的植酸酶量为一个酶活性单(U)。1.5 酶活性质分析1.5.1 最适反应温度 分别将突变前后菌株诱导表达后稀释的粗酶液分别在30、37、45、50、55、60和65范围内进行酶促反应，测定酶活，得到反应的最适温度。1.5.2 最适反应pH 将突变前后菌株诱导表达后稀释的粗酶液分别在pH2.0、pH2.6、pH3.6、pH4.6、pH5.6、pH6.6和pH7.6的乙酸缓冲液体系内稀释并直接加底物，在37进行酶促反应，