RNAi在HBV感染中应用研究.doc

RNA干扰在HBV感染中的应用研究摘要：近年来，科学家们发现了一种普遍存在的重要的基因调节机制，被称为RNA沉默或者是RNA干扰(RNA interference，RNAi)。RNA干扰是指由2123个核苷酸组成的双链RNA(dsRNA)所引发的生物细胞内同源基因转录后沉默的现象，是生物体在进化过程中普遍存在的一种基因调控机制。目前对由乙型肝炎(HBV)引起的病毒性肝炎尚无令人满意的治疗效果，而RNA干扰技术的出现为各类慢性HBV感染的治疗开辟了新的途径,利用RNAi技术的高效性和特异性抵御病毒感染及其它外源性核酸入侵的研究，已取得了很大进展，针对乙肝病毒感染这一全球性的健康问题，RNAi有着广泛的应用前景。本文对RNA干扰抑制HBV复制及基因表达的研究现状、存在问题及应用前景进行了综述。关键词：RNA干扰HBV 抗病毒乙型肝炎病毒(HBV)的持续感染呈全球范围广泛流行。HBV感染可引起急、慢性肝炎和重型肝炎，并与肝硬化、肝癌的发病密切相关，是严重危害人类健康的感染性疾病 。全世界有超过三亿五千万乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)携带者，面临患慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌的危险1，其中75分布在亚太地区，且慢性乙型肝炎预后不良.现有的治疗HBV的药物包括免疫调节剂和核苷类似物等虽能起到一定的作用，但疗效仍不令人满意2。高剂量重组干扰素的持续应答率仅约303，核苷类似物如拉米夫定虽然抗病毒活性较强，但停药后病毒复制水平快速反跳及耐药病毒株的出现，使得临床抗病毒方案的实施受到极大的阻碍 4.。近年RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术的出现，为各类慢性HBV感染的治疗开辟了新的途径。RNAi是指由双链RNA(dsRNA)分子mRNA水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程。dsRNA可抑制不同类型细胞的靶向基因表达，用特异性的抗体几乎检测不到靶向基因所表达的蛋白质。因此，RNAi技术又被形象地称为基因沉默(gene silencing)。RNAi是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)。RNAi具有高特异性和高效性，已经被广泛应用于植物、真菌、蠕虫和低等脊椎动物以及哺乳动物的基因功能研究5。有学者认为，RNAi技术用于抗HBV治疗，有望成为治疗乙型肝炎的革命性新方法，将有巨大的社会价值。1 RNA干扰发现的历史背景RNA干扰机制的发现得益于许多科学家的长期工作。1 9 9 0年有科学家给矮牵牛花插入一种催红素色素的基因，希望它能够开得更鲜艳，结果让人大惊，矮牵牛花完全褪色了，花瓣变成了白色j研究者对此极度困惑；1 9 95年，中国留学生郭苏在美国康柰尔大学肯尼恩坎菲斯指导下，试图阻断秀丽新小杆线虫的某个基因时，意外地发现反义和正义单链RNA都阻断了该基因的表达；可惜的是他们都没有能解释这个现象和继续研究下去。直到1 9 9 8年，安德鲁法尔和克雷格梅洛宣布他们发现了RNA (核糖核酸)具有可以干扰基因的机制。为以上现象找到了答案，矮牵牛花、线虫实验中所观察到的现象都是因为生物体内某种特定基因“沉默”了，导致基因“沉默”的原因就是R N A干扰机制。以前，人们都认为，RNA分子只是被当作是D N A (脱氧核糖核酸)与蛋白质之间传递遗传信息的“信使” ，安德鲁法尔的研究让人们认识到，RNA可以使特定基因开启、关闭，从而影响生物的生长和发育等。2006年，瑞典皇家科学院诺贝尔奖评审委员会把2 0 0 6年诺贝尔生理学、医学奖授予美国科学家安德鲁法尔和克雷格梅洛，据诺贝尔奖评审委员会称，这两位科学家获奖是因为他们发现了R N A(核糖核酸)干扰机制即“发现了控制遗传信息流动的基本机制”。诺贝尔奖评审委员会授予美国科学家罗杰科恩伯格诺贝尔化学奖，以奖励他在“分子水平上揭示真核生物基因信息转录过程”中的研究成就。瑞典皇家科学院在声明中说“如果转录过程停止，(生物)基因信息就不会被转移到机体的各个部位，生命体也将在数天内死亡” 。比如，人类现在难以攻克的多种疾病，癌症、心脏病都与基因信息转录过程发生紊乱有关。2 HBV基因结构特征HBV基因组是一不寻常的特异性结构，它是一环形的部分霹股的DNA分子其中完整的链称为长链或负链L（-）， 由3200左右核苷酸组成， 短链又称为正链S(+)， 其核苷酸数目相当于长链的5O100 条链的5 -末端之间的碱基互补构成粘性末端，维持其环状结构。在粘性末端的两侧各有一个由11个碱基对(bp)(5 TTCACCTCTGC)组成的正向重复顺序(DR)，位于核苷酸1824和核苷酸1590，分另IJ称为DRl和DR2。已证明HBV DNA的s(+)链不管多长均不具有编码蛋白的功能即不含有开放诲码框架(open reading frame，ORF)，而L(一)链则含有所有HBV的蛋白密码， 其转录的4个ORF，分别称为S，C，P和x，P区最长与另外的三个区重叠，这样，L(一)链被阅读一次半。S区编码HBV包膜蛋白， 分为前Sl(PreS1)区， 前St(PreS)区及S基因。C基因区编码核心抗原(HBeAg)和e抗原(HBeAg)。该区有两个起始密码子，一个位于核苷酸1814， 另一个位于核苷酸1901， 二者之间含有的29个密码子称为前C区(PreC)， 其它则称为C区。P区转译的产物是富含组氨酸的碱性蛋白，分子量约为90，000遭尔顿， 与DNA多聚酶相似x区编码145到154个氨基酸的多肽，其功能尚不清楚， 用合成多肽的抗体从HBV感染的旰组织中检测出相应的多肽为P28，而在原发性肝癌患者血清中测得与HBxAg起反应的抗体， 但抗-HBx是否能作为HCC的血清学标记尚有待证实6。四个不同的编码框(ORF)：C、P、S及X，被转录成mRNA，这些mRNA可成为RNAi 的作用靶位。RNA干扰作用的机制及其相关性质RNAi包括起始阶段和效应阶段。在其起始阶段7，加入的小分子RNA被切割为2123核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNA，siRNA)。有证据表明，一个称为Dicer的酶(RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员)能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的dsRNA，将RNA降解为21 bp的dsRNA，每个片段的3 端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物，从而形成所谓的RNA诱导沉默复合物(RNAinduced silencing complex，RISC)。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程8 。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上，mRNA与siRNA的反义链结合，置换出正义链，这时RISC上的核酸酶以一定的间隔，在被识别的2个核酸中间进行切割，规律性地从两端产生21个核苷酸的RNA片段，从而切割具有同源序列的基因转录体。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含1个siRNA 和1个不同于Dicer的RNA 酶。被降解的mRNA片段及未被降解的完整mRNA均可作为引物， 在RNA 依赖的RNA 聚合酶(RNAdependent RNA polymerase，RdRP)作用下，合成更多的dsRNA。新合成的dsRNA再被Dicer酶识别并切断，形成新的siRNA，进一步作用于靶向mRNA。只需少量的dsRNA即能完全关闭相应的基因表达，这就是RNAi的高效性94RNA干扰应用于HBV的实验技术流程41 目标序列的选择靶细胞的选择。目前研究HBV的靶细胞主要有13倍的HBV的真核表达质粒pHBV13转染的HepG2细胞和HepG22215细胞，可通过文献查找细胞内插入的HBV的详细基因序列。同时对细胞进行鉴定。 从转录体(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3 端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。 将潜在的序列和相应的基因组数据库(人或者小鼠、大鼠等)进行比较，排除那些和其他编码序y1EST同源的序列。选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个(24条)靶序列siRNA，以找到最有效的siRNA序列。设立实验对照，如设计有12个碱基错配的序列，或随机变更siRNA的碱基排列顺序或空白对照。42 siRNA表达载体的选择 目前RNAi抑制HBV的研究方面，siRNA的产生多选用其表达载体，pSilencer siRNA表达载体系列是用于在培养的哺乳动物细胞中表达siRNA的一系列载体。在载体上包含有RNA Pol启动子，最好带有人的u6或H1启动子(美国Ambion公司有此产品)43 转染细胞将制备好的siRNA表达载体转染细胞的方法主要有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE葡聚糖和聚凝胺、机械法和脂质体法等，具体选择应根据靶细胞的特性、试剂反应条件及实验室条件而定。目前多采用脂质体法，此法可稳定转染，也可瞬时陛转染所有细胞，适用性广、转染效率高、重复性好，但转染时需去除血清。44 细胞培养的注意事项 通常健康细胞的转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。大多数培养液在使用前需要加胎牛血清或马、牛血清。细胞培养常用的血清是一种包含生长因子及其他辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差异。血清质量的变化直接影响转染效率。45 结果分析：免疫荧光，Western印迹分析，用自动免疫分析仪及配套的微粒子酶免分析法(MEIA)诊断试剂盒，RTPCR检测目的mRNA，PCRHBVDNA定量。5RNA干扰抗HBV相关的最新实验进展目前，针对慢性乙型肝炎感染的各种抗病毒治疗，虽然能使病人血液中的病毒载量降到了低水平的程度，但是持久的病毒学反应却还远不能令人满意，因此，人们需要新的武器来对付这种疾病，RNAi无疑是一个不可多得的选择。在下面几个将要提到的几个研究中，它已经有效地抑制了病毒的复制。Konishi等11 通过化学合成siRNA的方法在一种能够持续产生HBV感染颗粒的肝癌细胞系中成功地抑制了病毒复制。研究通过测定细胞分泌在培养液中HBsAg的滴度，来评价RNAi抑制病毒的效率，发现针对多聚酶区的siRNA为78，针对S区的siRNA为42，而作为阴性对照的随机siRNA不能起到沉默RNA的作用。这一结果显示靶区域的选择在RNAi过程中起到了重要的作用。但是目前来看，尚无系统的方法能够有效地预测哪些靶位更有效。Hamasaki等12 用针对核心区的siRNA 与全长HBVDNA质粒共转染进入Huh一7和HepG2细胞并以针对绿色荧光蛋白(GFP)的siRNA作为阴性对照的研究中发现HbeAg水平下降了5倍，Southern印迹试验也证实了病毒复制的下降。Ying 13等使用了两种不同的细胞系：一种产生野生株的HBV，另一种产生针对拉米夫定耐药的HBV。当应用了针对核心区域的siRNA后，利用实时定量PCR测定发现两种细胞系的病毒水平皆呈剂量依赖性的下降。Shlomai和Shault 14利用一种以质粒为载体的RNAi来抑制HBV。这种方法是通过位于该质粒H1RNA启动子后的短发卡状RNA (shRNA)的表达，来起到与siRNA相同的作用。这些shRNA同样也抑制了在持续表达病毒颗粒的细胞中HBV病毒的复制。这项研究的靶位选择了核心基因和x基因。研究首先构建了能够针对上述靶位的质粒，然后利用这些质粒转染细胞进行RNAi，发现能够在Western蛋白杂交中明显降低蛋白的表达。研究还发现了siRNA要求高度的序列特异性，发生变异的序列将不能够抑制蛋白的表达。MaCafrey15等 以质粒为载体，利用RNAi方法成功在小鼠体内抑制了HBV。他们设计了7条分别针对HBV不同区域的shRNA，他们发现除1条外，其余6条都有效降低了Huh7细胞培养液中HBsAg的含量。在8d的培养后能够抑制HBsAg超过90的两条shRNA被用来进行下一步的小鼠体内试验。这些通过尾静脉注射入小鼠体内的的质粒不但抑制了HBsAg和HBcAg，而且也抑制了病毒的复制。其中一条shRNA在体内试验中还显现出了非特异性沉默效应。虽然这条shRNA设计针对的靶位是HBV35kb转录子，但是它也能够抑制24kb和21-kb的转录子。虽然这种序列非依赖的沉默效应增强了抗病毒的效果，但在实际的RNAi治疗中这种非特异性的沉默并不是研究人员期望得到的。6RNAi应用展望应用RNAi技术作为抗乙肝病毒治疗的工具有很多优势： 特异性针对病毒转录产物从而阻断病毒复制，不会激活非特异性细胞反应，因此将不良反应降到最小；RNAi具有高效性，少量的siRNA就可达到抑制HBV mRNA，降低病毒表达产物的作用；RNAi可以针对病毒基因保守区发挥作用，从而限制了病毒产生逃避突变株的能力；siRNA可以在病毒非活跃复制的情况下发挥其抑制病毒基因转录及降低蛋白表达水平的作用，因此可以作为抗病毒药物拉咪呋啶的辅助治疗16。作为一种新的基因治疗技术，RNAi技术还有许多问题有待于进一步研究，如何选择最有价值的靶序列?使用什么方法合成siRNA更加省时且经济有效?使用什么样的载体及以何种方式向细胞内转导的效率最高? 导入后怎样才能够持续稳定的表达siRNA ，从而达到持久抑制病毒转录和复制的目的等等，还需要在不断认识问题，分析问题，解决问题的基础上，逐步建立完善的RNAi实验技术与应用研究的平台，才能够使RNAi技术真正为人类基因功能研究和基因治疗发挥作用。参考文献1Mast，EE，MJAoter&HSMargolis,1999，Strategies toprevent and control hepatitis B and C virus infections：a globalperspectiveVaccine，17(1314)：1730-17332Haw，YF，2002，Therapy of chronic hepatitis B：currentchallenges and opportunities Vird Hepat，9(6)：3933993 Yao N，Hong Z，Lau JYApplication of structural biology tools inthe study of viral hepatitis and the design of antiviral therapyJGastroenterology，2002，123(4)：1350 4 Papatheodordis GV，Dimou E，Papadimitropoulos V Nueleosideanalogues for chronic hepatitis B：Antiviral eficacy and viral resistanceJAm J Gastroentero1200297(7)：16185 Misquitta L，Paterson BMTargeted disruption of gene function inDrosophila by RNA interferenee(RNM)：A role for nautilus in embryonic somatic muscle formation J_ Prec Natl Acad Sci USA，1999，96(4)：1456 Tiollais， Pet al 1985 NatHre 317:4897Zamore PD，Tuschl T，Sharp PA，et RNAi：double strandedRNA directs the ATP dependent 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