发酵法生产透明质酸.doc

发酵法生产透明质酸透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一种大分子的粘多糖,是一种由-D-N -乙酰氨基葡萄糖和-D-葡萄糖醛酸为结构单元,-1，4-糖苷键连接成的一种链状高分子粘多糖。其分子量在几十万到几百万之间，又称糖醛酸，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，为目前所公认的最佳保湿成分，在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域有广泛的应用。 透明质酸的提炼的方法有三种：组织提取，微生物发酵和化学合成。组织提取法和化学合成法的成本高，产量低，受原料资源限制，不能满足市场需求。而微生物发酵法生产透明质酸具有不受原料资源限制、成本低、产量高、有较高的相对分子量、分离纯化工艺简便、易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展方向，因此开发先进的微生物发酵法生产HA的技术十分必要。目前HA产业前景广阔，发酵法己成为HA生产的主流工艺，而发酵法生产HA的工艺仍需进一步完善。微生物产HA的研究可以追溯到上个世纪30年代，1937年，Kendall发现链球菌可以产生HA，后来发现主要是一些A群和C群链球菌，它们具有合成与代谢以HA为主要成分的荚膜的能力。随后很多人进行了大量的研究。研究结果证明某些种属链球菌在一定的环境条件下，能同化吸收葡萄糖或其他碳源，以代谢物形式产生HA。随后经过不断地选育菌种和优化工艺，借助现代深层发酵技术与设备，HA的微生物发酵法被建立和应用起来。目前多选用链球菌、乳酸球菌类等（因此以下均以链球菌举例说明）。日本用发酵法生产了HA制剂并对该产品做了大量的药效、毒理、药代动力学等非临床实验和临床实验。结果表明，发酵法生产的HA无局部及全身毒副作用、安全性高、疗效确切。发酵法生产透明质酸主要包括两部分：发酵部分和下游提取工艺部分。发酵法生产HA的质量主要取决于菌种、培养基和分离提纯工艺的选择。一.发酵部分：经过阅读与分析文献，我个人将发酵部分划分为以下几个模块：1.菌种的筛选 2.菌种的诱变3.培养基配方的优化4.菌株的最佳培养条件首先以链球菌制备HA的过程为例简单介绍一下发酵法生产透明质酸的基本流程：链球菌复苏培养后，用诱变剂诱变，挑出不溶血、不含HA酶的高产率菌株。进行稳定传代后增菌培养，所得的菌种即可作为生产菌株。放入发酵培养液后，在通风搅拌的情况下发酵40小时，对粘稠的发酵醪进行提纯分离等处理后得到分子量高、粘度大的HA。下面我将针对这几个模块分别做详细的叙述与分析。1. 菌种的筛选： 优良的微生物菌种是发酵工业的基础，得到这类产物的两个成功要素在于产生菌的选择和筛选方案的确定。以目的代谢物透明质酸为目标筛选出能产生它的菌种是前提，设计出科学合理的筛选方案是事关筛选工作成败的关键。菌种初筛方法必须快捷、简便、有效，才能一次或多次从现有菌群中把多数无用的微生物淘汰掉，把少量有用的微生物筛选分离出来。经研究发现在牛鼻粘膜上分离到的HA产生菌种即乙型溶血性链球菌比较适合用来发酵。1.1筛选步骤：牛鼻粘膜-稀释分离涂平板-初筛菌株-复筛摇瓶发酵-发酵液离心-上清液乙醇沉淀-定性分析-获得目的菌株-斜面培养1.2 菌种筛选操作方法：1.2.1 初筛：将牛鼻黏膜用01蛋白胨溶液分成梯度涂于血琼脂平板，37，培养24h。观察各菌落在血平板上的溶血性和形态，用接种针挑起看其黏度。荚膜染色并镜检。1.2.2 荚膜染色抹片自然干燥，甲醇固定，以久贮的多色性美蓝液做简单染色。荚膜呈淡红色，菌体呈蓝色。菌落选择的依据：产生HA的菌落透明度很高，隆起，呈水滴状色泽近似蛋清。1.2.3 复筛发酵摇瓶中接人初筛疑似菌株，每株五瓶，在200 r/min、37下培养24h。取复筛发酵液100ml，离心4000 r/min，20min。上清液用三倍体积无水乙醇沉淀。沉淀物用红外吸收光谱作定性分析。1.2.4 红外吸收光谱法取HA 2mg，KBr压片，用IR一400红外分光光度计在40005000m-1范围内扫描。发酵液提取物的红外吸收图谱在3400 cm-1附近有强的OH伸缩振动的特征吸收，表明有多羟基结构；在2900 cm-1附近有CH2的伸缩振动，1620cm-1及1560cm-1附近有CO、CN的伸缩振动，表明存在着乙酰氨基结构；在1400cm-1和1320cm-1附近有COC的伸缩振动和OH的弯曲振动偶合产生的两个吸收峰，表明存在着糖醛酸上解离羧基结构和多糖羟基结构。上述结果提示筛选菌株的产物呈较典型的HA红外吸收图谱。1.2.5 测定通过测定各种物质的含量来判断筛选结果是否正确。(1)HA中葡萄糖醛酸含量的测定。参照硫酸-咔唑法进行测定。(2)菌体量的测定：采用紫外可见分光光度计法，将培养液稀释后，在660nm处测其OD值。(3)HA含量测定：采用Bitter-Muir氏法。以葡萄糖醛酸标准品为对照，测得样品溶液中葡萄糖醛酸的含量。由于葡萄糖醛酸的含量占整个产量的4838，因此测得葡萄糖醛酸的含量除以4838，再乘以稀释倍数就可以得到HA的产量。(4)葡萄糖含量测定：采用3，5-二硝基水杨酸法。(5)蛋白质含量：参照考马斯亮蓝法测蛋白质含量，以牛血清白蛋白(BSA)标准品做对照。(6)相对分子质量测定：采用粘度法。使用05-06mm的乌式粘度计，参比液为02molL氯化钠，测定温度30，三点外推出特性粘数，根据公式=3.6x10-4Mr的0.78次方，计算出产品的平均相对分子质量Mr。2. 菌种的诱变： 以链球菌为例，野生型的链球菌多会产生溶血素(Streptolysin)，溶血素混入成品HA，会使HA的品质降低。一般情况下不会超过2g/L，得到的HA分子量也很低,所以规模生产必须获得非溶血性的菌株。因此必须经过诱变等手段获得HA产量高、优良性状稳定的菌株。诱变菌种的常规方法是以紫外线和射线为诱变剂的物理诱变方法和化学试剂如亚硝基胍、硫酸二乙酯等。但化学诱变剂污染环境、操作不安全，有待改进。诱变工作中，应该尽量利用菌落可以鉴别的特性进行初筛，把初筛选得菌株用摇瓶方法测定，可提高工作效率。21 菌种诱变步骤菌种-平面培养-同步培养-制备菌液-诱变处理-中间培养-稀释涂平板-突变株分离-保藏及扩大试验22 菌种诱变操作方法221平面培养将筛选的菌种挑取一环接种到平板培养基上，37，培养1416h。222同步培养从平面培养基上菌落上挑取2-3环接种到盛有20ml培养基的250ml锥形瓶中，37振荡培养1416h。223制备菌液将菌液进行离心3500rmin，离心10min后弃上清。供紫外线诱变处理的菌体用生理盐水洗涤2次，重新悬浮于5ml生理盐水中，摇匀后倒人盛有45mi灭菌生理盐水并带玻璃珠的100ml锥形瓶中，振荡10min，调整细胞浓度至10ml。供NTG诱变处理的菌体用01mol/L，pH= 60磷酸盐缓冲液来代替生理盐水，其它同供紫外线诱变处理菌体的菌液制备。224诱变处理2.2.4.1紫外线诱变处理：紫外线诱变的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构的扭曲变形， 阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起菌株的突变或死亡。(l)预热紫外线：紫外灯功率15W，照射距离30 cm，照射前打开紫外灯预热20 min，使紫外线强度稳定。(2)加菌液：两套标明1min和2min的无菌培养皿，分别加入3ml菌液和磁力搅拌棒。(3)照射：将上述两套培养皿磁力搅拌器上，打开皿盖搅拌照射1min和2min。盖上皿盖关闭紫外灯。2.2.4.2NTG诱变处理：(1)NTG溶液的制备：用分析天平称取1mg NTG于无菌离心管中， 然后加入01 molL，pH6o磷酸缓冲液1ml，于暗处振荡溶解。(2)诱变处理：取4ml菌液加人上述离心管中，充分摇匀，立即置于37水浴振荡处30min(NTG处理终浓度100；gm1)后，离心收集菌体，将含NTG的上清液倒人浓NaOH溶液弃去，用无菌水洗涤菌体3次，以大量稀释法终止NTG的诱变作用，最后向离心管中加5ml无菌生理水。2.25中间培养中间培养对获得稳定的突变株是极其重要的，只有让诱变处理后的细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞经过数代繁殖，隐性的变异就会显现出来，才可得到纯的变异细胞。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离，就会出现变异和不变异的细胞同时存在于一个菌落的可能，形成混杂菌落，导致造成筛选结果的不稳定和将来菌株的退化。同时，通过中间培养还可使变异的细胞数量增多，便于检出。将1ml诱变育种处理洗涤过的菌液，加20m1种子培养基的250ml锥形瓶中，37振荡培养2 h。226稀释涂平板取经中间培养的菌悬液用10倍稀释法在无菌水中稀释法在无菌生理盐水中稀释。紫外线处理的菌液取三个稀释度各01ml涂布于平板培养基上。NTG处理的菌液取三个稀释度各0.1ml涂布于平板培养基上。俱37，培养24 h。227突变株分离在血琼脂平板上挑取不具溶血性的或溶血性较弱的菌株进行摇瓶发酵，或再经多次诱变和发酵直至利用紫外比色选到较高产量的菌株。228紫外吸收光谱法将HA配成500gml的水溶液，用紫外分光光度计在190-300nm范围内扫描。从发酵液中提取的粗品HA的紫外光谱在196nm处有特征吸收，同sigma标样的相同。并且随着HA含量的增加吸光度值也变大。表明利用其最大波长处紫外光谱分析可以作为衡量发酵液中HA含量多少的依据。这样做节省了劳动和时间，而不必对HA进行干燥和称量。省略了中间环节，减少了误差。sigma标样在2 57nm和280nm处紫外吸收分别为0150和0105；若发酵液中提取的精品HA在257nm和280nm处紫外吸收大于这两个值，则表明发酵液中提取的精品HA较sigma标样存在核酸和蛋白质等杂质。同时我查到资料发现北京化工大学开发了发酵法生产透明质酸的新工艺。透明质酸高产菌株的选育采用紫外线诱变、Y射线、快中子诱变技术对已有的出发菌株进行了选育，开发了用磁场辅助Y射线、快中子诱变技术，得到了透明质酸高产菌，透明质酸稳定产量40gL-65g/L。用发酵法生产透明质酸质量稳定，而且其原料为淀粉等糖类，原料易得，大大地降低了HA的生产成本，为HA的普及推广应用奠定了基础，该成果通过了化工部组织的国家级成果鉴定，结论为技术水平达到国际先进水平，透明质酸发酵水平达465gl，据文献查询，目前国际透明质酸发酵水平最高为65gL。3. 培养基配方的优化： 首先以链球菌的营养需求为例，通常在含血清、脑心浸液等培养基上菌体才能较好地生长但这类营养物质价格昂贵，大规模生产成本太高，所以通常以蛋白胨、酵母膏或浸小粉、牛肉浸膏等的复合氮源代替。另外，有研究表明在发酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸，可以提高HA的产率。国内外文献资料大多使用葡萄糖作为碳源也有用蔗糖、半乳糖等研究链球菌的利用情况。可见，良好的培养基是微生物发酵的基础，培养基品质的好坏对发酵生产起着至关重要的作用，生产HA发酵的培养基一般包括碳源、氮源、无机盐、维生素和其它生长因子。生产HA的培养基中最常用碳源为葡萄糖，其次为蔗糖、麦芽糖，是因为绝大多数微生物对单糖的利用速度要比双糖和多糖快。在氮源的选择上，培养基中添加复配的氮源比单一的氮源效果更好，因为复配的氮源能提供不网的生长因子进行置补，利于细胞生长。因此，菌株不一样，其最适的培养基可能不一样，需要根据试验鉴定，同时也结合考虑成本以及工业化等问题来选择培养基成分。培养基中碳源，氮源（牛肉膏，酵母膏，蛋白胨），碳氮比，有机氨和无机氦的协同作用对菌种的生长起着主要作用。碳源作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质，是培养基的主要成分之一。葡萄糖是碳源中最易利用的糖，也是加速微生物生长的一种有效的糖。结果显示，采用葡萄糖作为种子培养基的碳源，接人发酵培养基后HA产量最高。在不同的葡萄糖用量条件下发酵活力存在差别，高葡萄糖浓度并非适宜。过多的葡萄糖过分加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，如乳酸、乙酸等导致PH值下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。氮源主要用于构成菌体细胞物质和含氮代谢物。微生物能直接利用氨基酸和有机氮中各种不同结构的碳架，而无须从糖代谢的分解产物来合成各种所需的物质。采用蛋白胨和酵膏为种子培养基的氮源，接入发酵培养基后HA产量最高。这与采用混合有机氮源接入发酵培养基后，其HA产量好于单一的有机氮源的相关报道符合。而无机氮源NAN03远较(NH4)2SO4。接入发酵培养基后HA产量高。这是因为生理酸性盐作为氮源时，其被利用后，培养基的PH值上升，而发酵过程中，菌体产生一些酸性物质使PH值不断降低，会影响菌体生长，降低HA的产率。因此，NaN03可以抑制或减轻酸性物质对菌体的毒害，维持发酵液适当的pH值。培养基中的碳氮比的影响极为明显。氮源过多，会使准体生长过于旺盛，不利于代谢产物的积累。氮源不足，菌体繁殖量少。随着碳氮比的增高，种子液中菌体量随之减少，当碳氮比为1：1时，菌体量也基本稳定于最大值。这与培养菌体的种子培养基中氮源含量应丰富的原则相一致。此时，HA发酵也处于最佳状态，符合HA的合成与菌体的生长相偶联的报道。为了既满足菌体快速生长的需要，又要提高HA产量，配合使用有机氮源和无机氮源，以充分发挥它们作为迟效性氮源和速效性氮源的各自优势是很有必要的。在以为蛋白胨和酵母膏为主的条件下，少量添加NaNO3有助于菌体生长和HA的形成。 Ogrodowski等发现添加溶菌酶能够提高透明质酸的产量这是因为菌种需分泌大量的透明质酸以保护其细胞壁免遭破坏；同时，溶菌酶能诱导透明质酸合成酶的活性。在发酵过程中添加含有羟基的酚类化合物如苯酚、丹宁等能大幅提高透明质酸的产量；此外葡糖胺、丙酮酸、尿嘧啶等因为是HA合成的前体物质通过添加也可获得高分子量的HA。4. 菌株的最佳培养条件： 发酵过程中的条件控制非常重要，对HA的产量影响很大。先以链球菌为例简单介绍：链球菌是一种乳酸菌，产生乳酸、乙酸等小分子有机酸发酵过程中需要用碱液进行中和以维持适当的pH值。在HA的发酵过程中，pH值一般控制在70左右低于55或高于85菌体都不再生长。MRJohns等发现以Streptococcus zooepi demicus生产HA在不通气的情况下,6.70.2为其较适pH值。我总结了几项影响较为显著的。温度，pH值，搅拌转速，发酵时间，接种龄，溶解氧和培养方式。综合文献，可以发现酸度通常控制在65-75，但对于最佳的数值，还有争议，这可能是实验用的菌株和发酵液的成分不同所致。搅拌速率常控制在100800转分之间。发酵温度一般控制在37度。培养条件是影响HA的产量和分子质量的关键因素。适宜的发酵条件不仅有利于菌体的生长，而且使菌体向有益于产物合成的方向进行。41 温度对HA产量和分子质量的影响温度能影响微生物机体内酶的活性、细胞质膜的流动以及物质的溶解度。Armstrong等发现，温度高于或低于37，HA的产量和分子质量都会下降。还有研究者解释此现象，认为之前用于生产HA静链球菌大多数是来自哺乳动物体内的细菌，因此，要在体外培养生产更多的HA，需要提供类似体内生长的人工培养环境，其生长适宜温度与宿主体温37相近。42 pH值对HA产量和分子质量的影响根据Michael等人的研究，pH为670。2时，HA产量最离。Armstrong等人也认为pH对HA的产率和产量影响较大，并且认为pH为67最有利于兽疫链球菌生产HA。球菌生产HA，是典型的乳酸型发酵，发酵过程中大量产酸，使发酵液pH值降低，因此，pH值应偏碱性。罗瑞明也认为PH值对菌体合成HA和乳酸有不同的影响，pH为75时最适于细胞生长，也最适于HA的合成，葡萄糖消耗也最彻底，而pH值高于8时对乳酸合成有利。Armstrong等认为pH对HA的分子质量基本没有影响。4.3 接种龄和溶解氧对HA产量和分子质量的影响431种龄的确定种子质量的好坏不仅取决于培养基组成， 还与种子的生理性有关。在摇瓶发酵中，过于年轻的种子，会由于菌体量不足，使发酵前期生长缓慢，整个发酵周期延长，产物开始形成的时间推迟；过老的种子会引起生产能力下降，菌体过早自溶。所以说，合适的种龄对于得到较好的发酵结果非常重要。一般隋况下，种龄选取在对数生长中后期，培养液中菌体量尚未达到最高时较宜。此时，种子即可保持旺盛的细胞活力，又可获得尽可能多的细胞量。从图l中可以看出，菌种接人种子培养基04h为生长延滞期，4-20h为对数生长期。20h后入静止期。因此，本试验接种种龄为选择14-16h。用红外分光光度计进行光电比浊法测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值。以时问作为横坐标，OD值为纵坐标，用未接种的培养基作空白对照，绘制诱变处理后的菌株在种子培养基的生长过程曲线。进行光电比浊测定的波长选用660mm。每隔2h取样测定OD值。432 溶解氧对HA产量和分子质量的影响对多数微生物发酵来说适当的溶解氧有利于其代谢产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。链球菌属于兼性厌氧菌，有氧和无氧条件下，都可以生长，发酵时通气并不明显影响细菌的生长，但能提高HA的产量并非供氧愈充分产物形成愈好，相反会造成产量下降。这可能是由于在摇瓶条件下当氧含量较高时，产生的大量乙酸所造成的PH值下降进而抑制了菌体的代谢，远大于在葡萄糖代谢中产生更多ATP对UTP的有益影响。二.下游提取工艺部分：下游提取工艺部分包括HA的分离和提纯工艺。通过考察菌种的生长曲线和不同工艺对HA的影响来初步确定工艺，使该菌种HA产量有一定程度的提高。首先以分离纯化链球菌HA为例见到介绍：通过加杀菌剂或7580度加热来杀灭发酵液中的菌体。HA含量较高时，发酵液的粘度很高，直接过滤或离心除菌体非常困难，需要先进行稀释。然后乙醇沉淀、氯仿处理、离子交换、超滤等方法进行分离纯化，最后用有机溶剂沉淀、真空干燥或冷冻干燥制得HA精品。对发酵法生产HA进行分析可以知道：从发酵液中提取HA的过程中存在许多困难。例如要解决发酵液中有大量菌体的问题，因为这些菌体可以分泌一种可解离HA的透明质酸酶，使HA分子量降低，从而影响到HA产品的质量；发酵液中的HA含量高、分子量大，所以发酵液的粘度很高，使分离的过程非常不便；因HA易因酸、碱或加热处理而分解，又易在铁、铜等金属离子和抗坏血酸或半胱氨酸等还原剂共存下，经氧自由基、x射线、Y射线、紫外线和超声波作用而降解；它还可被透明质酸酶和硫酸软骨素酶分解等。这就决定了从发酵液中分离HA的处理量和复杂程度要比组织提取法大的多，完全照搬组织提取的方法是不可行的，必须从发酵法自身特点出发，寻求适宜的提取方法，设计出一条新的工艺路线。1.HA的分离提纯方法11 HA的分离提纯步骤发酵液预处理-发酵液离心-上清液醇沉-沉淀盐溶-溶液CPC络合-HA-CPC沉淀解离-乙醇沉淀-真空干燥-HA精品12 HA的分离提纯操作方法1.2.1 发酵液的预处理HA发酵液粘稠，不易将HA与菌体快速有效地分离，而菌体本身产生的透明质酸酶，会使HA降解，从而降低HA的分子量。因此在从发酵液中提取HA之前，需要对发酵液进行预处理，使其中的透明质酸酶失活，防止HA分子量损失。122 HA粗提新鲜发酵液离心4000rpm，20min，取上清液加3倍体积无水乙醇沉淀出HA粗品。123 CPC络合沉淀用01molL的NaCl溶液溶解，加入过量的1% CPC水溶液，形成HACPC络合沉淀，离心4000rpm，20min，得到络合沉淀。124 HA精提将络合沉淀置于04molL NaCl液中搅拌解离至沉淀溶解。然后加三倍体无水乙醇沉淀，沉淀用丙酮脱水后真空干燥得HA精品。分离纯化发酵液中的HA有多种报道，如有机溶剂沉淀法、离子交换法等。沉淀HA的有机溶剂有乙醇、丙酮、乙酸等。乙醇沉淀法是制备粘多糖中最常见的一种。链球菌HA的分离目前也多采用此法。为了使HA完全沉淀溶液中应有足够的离子强度。乙醇所沉淀的HA浓度约在l2之间乙醇分级分离的缺点在于其分辨率低即一组很相似的多种成分以及它们个体的不均一性如分子量、硫酸化程度、糖醛酸含量的差别不能达到完全分离。1973年keSheng-an提出一套改进的工艺，即用季铵盐分离HA和其它粘多糖。此外。纯化HA还有许多方法：用丙酮浓缩、冰醋酸和乙醇析出法；活性炭和纤维素粉末混合制成吸附柱，让经乙醇析出的HA粗品反复通过吸附以除蛋白杂质。发酵法生产透明乳酸仍存在一些局限，其中对发酵液中HA产物的提取工艺不成熟是一个重要方面，具体表现在缺少一条被广泛认可和接受的可用于工业生产的下游分离工艺。三展望：国外自20世纪70年代开始研究利用发酵法生产HA,本资生堂在20世纪80年代后期实现了发酵法生产HA的工业化。HA成功应用于其生产的各种化妆品中至今国际上发酵水平已达到67 g/l。我国的HA年产量在2t左右，山东福瑞达等几家已经开始通过发酵法生产HA，但总体规模较小，还远远不能满足市场的需求。因此我们必须从各个方面改进发酵法生产HA，使之在中国达到广泛化、工业化。 要加快发酵法生产HA的研究开发，我个人认为应主要从以下几个方面着手：(1)从菌种入手，筛选诱变性能优良的菌株，或通过基因工程手段构建新的工程菌，为工业化生产透明质酸提供优良菌株。(2)从发酵工艺着手，优化工艺条件，同时开发与高黏度发酵液匹配的生物反应器，建立完善的在线监测、将IT技术引入发酵工艺的控制过程中。(3)加强对提取工艺的进一步开发，得到一条低成本、低污染、易于工业化的下游提取工艺。(4)开发快速、简便的分析技术。参考文献：1. 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