水蛭养殖及深加工技术大全.doc

水蛭养殖及深加工技术大全高效表达重组水蛭素及其生产方法本发明涉及一种生物工程的抗栓药物及其生产方法，具体而言是涉及一种新型水蛭素及其生产方法。采用全人工合成的方法获得变异的HV2全基因，在其5端上 游加入一段合适前导序列。构建毕赤酵母分泌型表达载体pHV2，载体转化宿主细胞GS115，并整合入宿主细胞的染色体中。筛选高效表达菌株，经优化发酵 诱导、分离纯化步骤，提高了重组基因产物的生产效率，产物表达水平和生物学活性，以及对抗凝、抗栓的药效学研究表明，高于文献报道，这为水蛭素II型的大 规模生产和临床应用的深入研究提供了物质来源。菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取技术本发明提供了一种菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取方法，是通过引进优良种源或野外捕捉到健壮的菲牛蛭，进行人工分级分段驯、喂养，进行人工繁殖，待饲养到 一定程度，采用化学物质刺激鲜活菲牛蛭使其分泌出唾液，然后对其唾液进一步分离过滤得到水蛭素粗品，再将水蛭素粗品进行深加工得到符合医用的水蛭素，该菲 牛蛭含抗凝血物质比其它品种菲牛蛭含量高，药用效果好，提取水蛭素方法简单，提取水蛭素后将菲牛蛭放回水池养殖，相隔一周或10天又可以再提取，每条鲜活 菲牛蛭可以反复提取6-7次，每次能提取水蛭素粗品6-7毫升左右，产品质量好，又节约资源，提高了菲牛蛭的利用价值。水蛭溶栓软胶囊及其制备方法一种水蛭溶栓软胶囊，包括囊壳和囊壳内的水蛭提取物；其制备方法包括：(1)明胶先加水使其膨胀，将甘油及剩余的蒸馏水在煮胶锅中加热至7080，混 合均匀，加入膨胀的明胶搅拌溶化，加入防腐剂，保温12小时，静置过滤，保温待用；(2)将蜂蜡加热熔融后加入植物油与水蛭提取物形成的混悬液中，搅拌 均匀呈流动的半固体状；或在均质机中分散均匀；(3)压制法或滴制法制备软胶囊；本发明能够克服已有剂型的缺点，药物的有效成分高度分散在基质中，且特殊 情况下不用水即可吞服。生物利用度高，外形美观，能掩盖药物的不良嗅味，满足该类剂型在外观、崩解和理化稳定性方面的标准。水蛭素口服缓(控)释剂型水蛭素是迄今为所知最强的凝血酶抑制剂，天然水蛭素和应用基因工程技术生产的重组水蛭素都已经应用于临床上心脑血管方面疾病的治疗。现存的国内外水蛭素类 药物在剂型设计上都是胃肠道直接溶解给药和注射给药。给药后药物在体内寿命较短，有效血药浓度仅能维持1小时左右，难以适应大多数慢性高凝状态疾病患者长 期抗凝治疗的需要。本专利发明的口服水蛭素缓(控)释新剂型延长了水蛭素在体内的寿命，有效血药浓度维持可达6-24，并有较好的生物利用度，具有潜在新 一代口服抗凝药物的价值。重组水蛭素口服肠溶缓释制剂本发明涉及重组水蛭素(hirudin)口服肠溶缓释制剂的组分、制备和应用范围，经动物试验证实，该类制剂口服给药对家兔颈静脉血栓形成有明显的抑制作 用，对大鼠外周血有显著的抗凝功能。该制剂能有效防止胃肠蛋白酶对重组水蛭素的降解作用，适用于有血栓形成倾向患者的抗凝治疗。蛇粉和水蛭粉组合物及制备方法本发明公开了一种蛇粉和水蛭粉组合物，该组合物中各成份的重量百分组成是水蛭粉10-30和蛇粉70-90。该组合物的制备方法是先把水蛭用水洗 干净后，用热水泡死，蛇除去内脏，然后进行蒸汽灭菌、高温干燥，把干燥后的蛇、水蛭原料按比例混合后，进行超细粉碎，最后进行分装，就得到成品。本发明具 有增强人体体质、提高人体免疫能力、改善血循环能力的功效。一种水蛭提取物及其生产方法和用途本发明涉及一种水蛭提取物及其生产方法，以及该提取物的应用，其特征是该提取物采用菲牛蛭活体生理盐水提取，或活体冷冻融溶后生理盐水提取，并经冷冻干燥 方法制备而成的固体提取物。该提取物生产方法简单，成本低廉，保存期长，采用抗凝血酶活性分析法进行质量监控，使质量稳定，产品的疗效有保证。该提取物适 用范围广泛，可用于制备治疗血栓引起的心脑血管疾病的药物。水蛭素与亲脂化合物的水蛭素结合物本发明涉及由水蛭素和一种或多种亲脂化合物形成的水蛭素结合物，其中，所述亲脂化合物的辛醇水分配系数大于1.8，而且与水蛭素化学相连，并涉及其制备和其应用。用水蛭素和乙酰水杨酸治疗未溶栓的急性心肌梗塞病人的方法本发明发现将水蛭素和乙酰水杨酸（）组合物给予未经任何溶栓剂治疗的病人，抑制或预防心肌或心血管疾病。本发明进一步涉及到血小板失活的药物乙酰水 杨酸和直接的凝血酶抑制剂水蛭素用于治疗未经溶栓治疗的急性心肌梗塞病人的药物组合物。一种含有水蛭素和协同物而不含任何溶栓剂的药物组合物在本发 明的治疗和预防方法中是特别有用的。无腥味水蛭粉炮制工艺一种无腥味水蛭粉的炮制工艺，其特征是将水蛭洗净入高温油内炸焦黄后晾干研磨成粉。经炮制的水蛭无腥 味，便于服用，可制成口服粉，治疗中风、半身不遂、心脑血管疾病，还可制成保健食品。由南美水蛭中提取和纯化抗凝血成分申请人已经从水蛭(H.ghilianii)的唾液腺提取物中分离出抑制因子Xa的物质。应用二乙氨乙基纤维素和肝素琼脂糖色谱树脂分离提取物，用递增 的盐梯度进行洗脱。应用结合到ffi-Cel-15树脂上的因子Xa，使提取物进行亲和色谱分离，用含有苄脒的进行洗脱。反相色谱分离得到几 种具有抑制因子活性的纯肽或纯蛋白质。本申请还公开了上述抑制剂的性质和临床上应用的组合物。含水蛭素衍生物的分泌物由大肠杆菌分泌型突变株获得水蛭素衍生物的方法包括：（）以编码水蛭素衍生物的基因直接定位于编码细菌信号肽的片段下游的方式构建重组载体， （）用构建的重组载体转化大肠杆菌分泌型突变株，（）在培养基中培养转化后的细菌，（）由培养基中获得水蛭素衍生物，并获得含有一个或更多个基因构 建的拷贝的重组载体，该构建基因编码由细菌信号肽组成的蛋白和水蛭素衍生物组成的蛋白，水蛭素衍生物末端氨基酸序列是 其中为，或。水蛭素的重组体制备方法利用重组的方法制备具有抗凝血酶活性的水蛭素或水蛭素样多肽。水蛭素或水蛭素样多肽优选在大肠杆菌或昆虫细胞中表达。具有改善稳定性的新的合成的异水蛭素本发明涉及具有改善稳定性和在，与5位有不同氨基酸的异水蛭毒，以及用遗传工程制备这类异水蛭素的方法，在酵母菌或大肠杆菌中获得表达的产物，经离子交换和反相层析法得到高纯度的异水蛭素。医用天然水蛭素的提取方法医用天然水蛭素的提取方法，涉及动物有效成分的提取。本发明采用从整体水蛭中提取水蛭素，先把水蛭浆加温后调节值至，又降温再调节 值至，然后离心脱水，残渣用生理盐水反复洗涤，母液透析后用以上乙醇分级沉淀，沉淀真空干燥后用水溶解，再次透析，最后真空干燥得到精品。用 本发明提取的水蛭素工艺方法简便，成品质量合格，而且收率提高到千分之四，从而大大降低了产品成本。重组水蛭素及其复合物用于制备预防和治疗血栓病药物本发明涉及一种药物和制备方法，特别是涉及一种以基因的人工合成方法制备重组水蛭素及其水蛭素与复合物的用于预防凝血和治疗血栓病的药物。$本发明为了提 高提供一种重组水蛭素与复合物按重量比例配成用于抗凝血和治疗血栓病的药物，及其制备本发明的药物方法。该方法简单，易于掌握合成，而且 大大地提高了制备的药物的药效。高分子量的脱硫水蛭素本发明属于凝血酶抑制剂领域，并且描述了经修饰的脱硫水蛭素的制备，更具体地讲是借助于遗传工程手段制备脱硫水蛭素。本发明的另一个目的是提供了使一种经 修饰的脱硫水蛭素变性并复性至具生物学活性的凝血酶抑制剂的方法以及使两种或多种所述脱硫水蛭素结合形成更高分子量的凝血酶抑制剂的方法。用亲合色谱法提纯水蛭素的方法本发明公开了一种从含有水蛭素和其它物质的溶液中提纯水蛭素的方法，其特征在于该方法包括使所述溶液经过金属离子亲合色谱法处理的步骤，其中铜离子（+）用作金属离子，磷酸盐缓冲剂用作洗脱液。动物血水蛭水解法及其水蛭水解血动物血水蛭水解法及其水蛭水解血，是关于动物血的新的利用方法，使食血水蛭充分吸取动物血，数分钟至数小时后用物理或化学方法使血液从水蛭体内流出，收集 流出的橙红色血液体。该法获得的水蛭水解血有含中小分子量蛋白质或肽的动物血，还含有水蛭素、消化血液的纤维蛋白酶（原）、透明质酸酶及其它目前难以测定 的有用的水蛭分泌物。$本法能有效降解动物血并使之含有医用价值的水蛭素、透明质酸酶等水蛭分泌物，水蛭还可多次使用，提高其利用率。基于水蛭素氨基酸序列的凝血酶抑制剂一种凝血酶抑制剂，它包括：大体积疏水性的第一部分，该部分能与负责蛋白酶解的凝血酶催化位点作用；和能维持下述氨基酸的疏水性和酸性的第二部分，其中的 氨基酸是指天然水蛭素在端非催化区乙酰水蛭素处的氨基酸。在第一部分和第二部分之间是共价键连接部分。该化合物实用于治疗血 栓形成类疾病。水蛭素本发明涉及一种中药制品，它包括，蜂蜜、水蛭，制成水蛭素。$其优点在于，水蛭素可点眼也可结膜下注射，使用方便，免去手术的痛苦。水蛭素作用于角膜使混 浊胶原纤维（即角膜实质层）透明。水蛭素通过结膜下注射方法作用于晶体使混浊的晶体蛋白从新溶解透明。玻璃体为透明的质酸，各种原因引起混浊水蛭素可使质 酸水解。以上疾病一旦发生，使用水蛭素均能使视力提高从而达到治疗的目的。新型分泌表达载体及其在重组水蛭素表达技术中的应用一种基于大肠杆菌(E.coli)L门冬酰胺酶信号肽新型简并基因的高效分泌表达载体及其在表达重组水蛭素中的应用，该载体包括tac强启动子、L门 冬酰胺酶信号肽新型简并基因以及pUC18高拷贝复制原点。将目的基因置于信号肽基因下游进行表达，目的产物便可形成正确的空间构象同时分泌至细胞外周质 或/及培养液中，本发明对表达生物活性蛋白或多肽时保证分子内二硫键的正确构象、方便表达产物的下游提取与纯化具有重要的意义。一种新型双功能水蛭素及其制备方法和应用本发明属生物技术领域，具体涉及一种兼具抗凝血酶活性和抗血小板聚集活性的双功能水蛭素(Bifunctional RecombinantHirudin)的蛋白质结构和制备方法及其应用。根据对野生型水蛭素的结构及其生化特性的分析，设计了新型双功能水蛭素分子结 构。化学合成突变体基因，然后与真核表达载体pPIC9K重组，转化甲醇营养型酵母GS115，筛选高表达工程菌。工程菌经发酵扩增，离心收集上清液，经 三步法纯化双功能水蛭素。所得产品冻干后，具有抗凝血酶活性并能显著抑制ADP诱导的血小板聚集，对于预防血栓性疾病的发生有明显的作用。水蛭素基因hv247k及其合成与表达本发明是以天然水蛭素的二十多种变异体的氨基酸序列资料为依据，以HV2型水蛭素为原型，将其第47位天冬酰胺(N)替换为赖氨酸(K)，选用甲醇酵母 Pichia pastoris所喜好的遗传密码子，合成八段脱氧核苷酸片段(引物)，采用递归式PCR(Recursive PCR)法进行拼接，最终得到可插入pPIC9质粒载体的新型水蛭素基因hv247k。hv247k基因在甲醇酵母Pichia pastoris中以分泌型表达，上罐发酵时，发酵液上清中新型水蛭素表达量不低于30,000ATU/ml(诱导50小时)，相当于2.0g/L的产 量，此为可检索文献中水蛭素表达量之首。来源于马尼拉水蛭的透明质酸酶,分离、纯化和重组生产方法本发明涉及一种来源于热带水蛭马尼拉水蛭(Hirudinariamanillensis)的新型透明质酸酶的分离、纯化和表征。因此，根据本发明，这种 新酶被称为“马尼拉水蛭酶(manillase)”。本发明还涉及马尼拉水蛭酶的重组生产方法，包括DNA和氨基酸序列以及表达载体和宿主系统的公开。最 后，本发明涉及马尼拉水蛭酶用于治疗目的的用途，例如，用于治疗心肌疾病、血栓事件和肿瘤。用于由大肠杆菌向培养基中分泌来制备Leu水蛭素的信号序列本发明涉及一种含有一种信号序列和Leu水蛭素序列的水蛭素前体及其制备方法和用途，并涉及一种寻找用于在大肠杆菌中分泌表达任何目的蛋白的信号序列的方法和用于在大肠杆菌中分泌表达任何目的蛋白的方法。用酵母分泌表达重组水蛭素本发明公开了一种用甲醇营养酵母分泌表达重组水蛭素的新型工艺方法。将合成的水蛭素基因放入酵母的表达质粒中，转化酵母后经分泌表达和一系列纯化步骤，可以制备得到高纯度、高比活性的重组水蛭素。重组水蛭素的药物组合本发明提供了一种治疗肝素相关性血小板减少症的药物组合，其主要成分包括可接受药物量的重组水蛭素及其医药上可接受的盐。对肝素相关性血小板减少症具有治疗价值。本发明中重组水蛭素主要有2大优点，(1)分子量小，几乎没有抗原性；(2)几乎没有毒性。一种有利于减少水蛭素降解的重组毕赤酵母菌株及其构建方法本发明提供了一种有利于减少水蛭素降解的重组毕赤酵母菌株，其内含有失活的KEX1基因，相对于未失活的KEX1基因，失活的KEX1基因的编码区及非编 码区插入了或缺失了DNA片段，更具体地，失活的KEX1基因的编码区缺失了第2891728位碱基序列，即其编码的蛋白酶缺失了第97576位氨基 酸，采用该重组毕赤酵母菌株表达水蛭素的发酵过程中，完整水蛭素占总水蛭素的比例达到6090，完整水蛭素产量达到2.9g/l。还提供了一种制备 上述重组毕赤酵母菌株的方法。本发明有利于减少水蛭素降解的重组毕赤酵母菌株能有效减少发酵过程中水蛭素的降解，提高水蛭素的产量，并有助于下游的纯化， 使得生产成本降低。一种测定人血浆和/或血清中重组双功能水蛭素的方法本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定人血浆/血清中重组双功能水蛭素的分析方法。本方法采用超滤法分离蛋白，解决了水溶 性的水蛭素和蛋白的分离问题；采用冷冻干燥技术，使血样中微量的水蛭素得以富集；采用质谱检测器，明显提高了检测的选择性和灵敏度；整个色谱分析过程时间 为15min以内。本方法样品取样少，前处理简单、快速、灵敏，分析周期短，可使水蛭素测定的选择性提高，灵敏度提高两个数量级，适合于重组双功能水蛭素 体内药物的浓度测定。本方法还可对游离重组双功能水蛭素的浓度进行测定。一种重组双功能水蛭素口服制剂及其制备方法本发明属药剂学领域，涉及重组双功能水蛭素特殊口服制剂及其制备方法。本发明利用超临界CO2流 体包衣技术，以聚乳酸为包衣材料包覆重组双功能水蛭素药物颗粒，制成口服制剂，所制备的制剂颗粒规则，表面光滑，外观均匀，无粘连，平均粒径在 70-105m，载药量、包封率高。通过动物实验，结果表明具有抗凝作用，口服后24小时内有效，具有缓释作用，能克服现有技术的缺陷，拓宽了临床应用 范围，宜用于治疗和预防慢性的血栓性疾病。一种水蛭的真空冷冻干燥工艺本发明涉及一种水蛭的真空冷冻干燥工艺，其将水蛭进行预冻后，进行切割，装盘。将该盘放入真空冷冻干燥机内冷冻，使水蛭内的水分冻结，在高真空状态中，进 行升华干燥，使得水蛭的含水量降到10以下，再对水蛭加热，进行解析干燥，使其含水量继续下降，直至达到要求。该工艺干燥后的水蛭保持了营养成分和活性 物质，含水率低。一种以菲牛蛭唾液为原材料的水蛭素生产工艺一种以菲牛蛭唾液为原材料的水蛭素生产工艺，属于中药制药领域，涉及动物有效成分的提取。目的是解决传统水蛭素提取工艺难以工业化生产的问题。该工艺用菲 牛蛭唾液提取水蛭素，可以工业化生产。菲牛蛭唾液用生理盐水提取，提取液煮沸、过滤、取滤液。固形物用生理盐水提取，过滤，取滤液。合并前后的全部滤液， 加入Lyphgel处理两次，过滤，去滤液。固形物用生理盐水提取，过滤。滤液煮沸后迅速冷却，冷藏过夜。离心，取上清液减压浓缩后再冷冻干燥成冻干粉。 本生产工艺简单，产品活力高，有很强的溶血栓作用。一种以菲牛蛭冷冻新鲜体为原材料的水蛭素生产工艺一种以菲牛蛭冷冻新鲜体为原材料的水蛭素生产工艺，属于中药制药领域，涉及动物有效成分的提取，目的是解决传统水蛭素提取工艺难以工业化生产的问题。该工 艺采用从整体菲牛蛭中提取水蛭素，可以工业化生产。先把菲牛蛭匀浆，浆状物用生理盐水提取三次，过滤。滤液煮沸、过滤除杂蛋白。收集滤液，经冷冻浓缩，醇 沉后得水蛭素粗品。再用生理盐水洗涤水蛭素粗品，然后浓缩洗涤液，最后冷冻干燥得到产品。本水蛭素生产工艺方法简单，成品质量合格。药理实验结果表明，用 本工艺提取的水蛭素有很好的药理作用。重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白及其药物组合物本发明涉及一种重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白(TNHH)、其cDNA基因、含有该cDNA基因的重组载体、用该载体转化的微生物、以及含有该重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白的药物组合物。一种重组水蛭素编码基因与应用本发明公开了一种重组水蛭素编码基因与应用。该重组水蛭素编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列2自5末端第7-459位所示。本发明还公开了一种重组 表达载体，该重组表达载体含所述水蛭素编码基因。将该重组表达载体导入多形汉逊酵母中可获得的重组菌。该重组菌能高水平生产重组水蛭素；所生产的重组水蛭 素具有高抗凝比活性。生产的重组水蛭素可制备血液或血浆的通用抗凝剂。一种水蛭素冻干粉针制剂及其制备方法本发明公开了一种水蛭素冻干粉针制剂及其制备方法，其特征在于从鲜水蛭提取水蛭素，纯化后加或不加药用辅料，制备成水蛭素冻干粉针制剂；其特征还在于本制 备方法不采用任何有机溶剂，采用超滤、离子交换柱层析、反渗透浓缩等方法纯化，得到纯度较高的水蛭素，加入或不加药用辅料制备成冻干粉针剂，药理实验结果 表明，本发明冻干粉针剂具有很好的药理作用。天然水蛭素复方药用保健品本发明涉及一种天然水蛭素复方药用保健品，其组分中含有天然水蛭素、海藻糖以及辅料，组分的重量百分比为天然水蛭素1-99、海藻糖1-99、辅料 0-30。本发明的天然水蛭素复方药用保健品无需其它处理工艺，在常温常压下，其天然水蛭素的活性物质能长期保持稳定，在食用时，其活性物质也不会受 高、低温处理而丧失，使人体能充分吸收天然水蛭素的活性物质，在治疗、美容化妆以及保健品方面都有着很好的效果。水蛭胶囊一种水蛭胶囊，其特征是胶囊内装有包括以下成分的混合物粉末(重量比)：水蛭(生)1.03.5份、虻虫0.10.9份、土元(炒)0.52.0 份、桃仁320份、红藤525份、大黄(酒炙)215份、黄芪1020份、熟地黄1040份、甘草220份；本发明药物不仅治疗淤血症，治疗 子宫肌瘤、卵巢囊肿、盆腔炎(附件炎)等慢性病效果较为显著，而且毒副作用小，对肠胃刺激小，在临床上具有十分可喜的良好疗效。水蛭蛋白酶抑素在化妆品中的应用本发明涉及一种水蛭体内提取的小分子蛋白质水蛭蛋白酶抑素在制备化妆用品制剂中应用，特别是利用其高效而特异性的弹性蛋白酶抑制作用，使皮肤组织内弹性 蛋白的含量增加，进而发挥其抗皱美容的功效。水蛭蛋白酶抑素可以经生物提取法或基因工程体外表达法制得，可以作为霜剂、膏剂、水剂、粉剂、油剂等多种美容 护肤用品的功效成分，制备化妆品制剂，具有良好的应用前景。活血中药三七和水蛭提取物制备的口服软胶囊药物制剂本发明涉及以活血中药材三七和水蛭提取物为原料制备的口服软胶囊药物制剂。本发明药物制剂是由0.025g-0.1g三七总皂苷(甙)和0.25g- 0.5g水蛭提取物制成。本发明所述制剂功能为活血祛瘀，通脉止痛，用于破血逐瘀，活血散瘀，通经，通脉止痛；冠心病、心绞痛、急性心肌梗塞；缺血性脑中 风，如脑血栓、脑梗塞及其后遗症，高血粘度，高血脂症，慢性高血压；动脉粥硬化，胸痹心痛、眩晕、胸闷及心痛、体胖者等属痰瘀凝聚者；也可用于症瘕痞块， 跌打周围血管病，弥漫性血管内凝血(DIC)；脑出血(CT证明出血量50ml)恢复期及后遗症的脑内血肿的吸收。毒性极低，安全有效。一种含有三七、瓜蒌皮、水蛭的治疗心血管疾病的中药制剂及其制备方法本发明涉及一种含有三七、瓜蒌皮、水蛭的治疗心血管疾病的中药制剂及其制备方法，其特征在于本组方中含有三七、瓜蒌皮、水蛭三种中药的活性成分为基本方，再根据临床证候进行不同中药的活性成分配伍，组成治疗心血管疾病的复方药物。活血中药三七和水蛭提取物制备的口服滴丸药物制剂本发明涉及以活血中药材三七和水蛭提取物为原料制备的口服滴丸药物制剂。本发明药物制剂是由5mg-10mg的三七总皂苷(甙)和50mg水蛭提取物制 成。本发明所述制剂功能为活血祛瘀，通脉止痛，用于破血逐瘀，活血散瘀，通经，通脉止痛；冠心病、心绞痛、急性心肌梗塞；缺血性脑中风，如脑血栓、脑梗塞 及其后遗症，高血粘度，高血脂症，慢性高血压；动脉粥硬化，胸痹心痛、眩晕、胸闷及心痛、体胖者等属痰瘀凝聚者；也可用于症瘕痞块，跌打周围血管病，弥漫 性血管内凝血(DIC)；脑出血(CT证明出血量50ml)恢复期及后遗症的脑内血肿的吸收。毒性极低，安全有效。重组水蛭素的新用途本发明公开了重组水蛭素的一种新用途，具体说是在制备预防和治疗白内障疾病的药物中的应用。人工水蛭蛋白酶抑素及其编码基因与该基因的高效表达方法本发明公开了一种人工水蛭蛋白酶抑素及其编码基因与该基因的高效表达方法，本发明提供的水蛭蛋白酶抑素，是具有序列表中序列4氨基酸残基序列的蛋白质，或 者是将序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列4的氨基酸残基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白质。水蛭蛋白酶抑 素的编码基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有93以上同源性，且编码相同功能蛋白 质的DNA序列。本发明的水蛭蛋白酶抑素具有高效特异地抑制弹性蛋白酶活性的作用，在酸碱状态下状态稳定，对于开发新的具有抑制弹性蛋白酶活性的药物具有 重要意义。用水蛭制备治疗脑出血的口服液及其配制方法本发明涉及一种用水蛭制备治疗脑出血的口服液及其配制方法，它是由下述组份(按重量比)组成：水蛭三七大黄612。本发明的优点是：针对现代医 学对脑出血病的治疗而科学地筛选药物，其产品具有活血化瘀功能，促进颅内血肿吸收之功效；可使血肿吸收时间提前，且日均吸血量明显高于不服本药品者，对入 脑室的患者效果甚佳，尤其适用于脑出血急性期，且疗效高，无毒副作用，药效肯定，对神经功能损伤小，并促进了神经功能的恢复，减少死亡率，治疗总有效率达 95，因此对治疗脑出血有着极其重要的意义。水蛭提取物美容化妆品及其制备方法本发明公开了一种美容化妆品，它包括水蛭提取物、油脂、脂肪酸酯、有机溶剂、香料、营养素和精制水，制备方法是把一定比例的油类、脂肪酸酯、有机溶剂和适 量的精制水混合后，加热至60-90，使其融合，待其冷却到室温时再加入水蛭提取物和适量的香精，然后充分搅拌使之完全均匀得到产品，本发明的美容化妆 品具有祛斑、祛痘、润肤、嫩肤、美白、预防皮肤衰老、增强皮肤弹性之功效，为高效、绿色美容化妆品。水蛭素突变体的一种编码基因与高效表达菌株本发明公开了水蛭素突变体的一种编码基因与高效表达菌株，目的是提供一种适于在大肠杆菌中表达，编码水蛭素突变体HV2-Lys47的基因。本发明提供的 水蛭素突变体基因是下列核苷酸序列之一：1)序列表中的SEQ ID ：1；2)编码序列表中SEQ ID ：2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID ：1限定的DNA序列具有95以上同源性，且编码相同功能蛋白质，能在大肠杆菌中表达的DNA序列。本发明还提供了水蛭素突变体和产生水蛭素突变体的 工程菌大肠埃希氏菌(Escherichia coli)pBH2CGMCC 0908。本发明可用于高效地生产水蛭素突变体HV2-Lys47。酶性止血剂拮抗水蛭素出血作用的用途本发明涉及一种酶性止血剂的用途，具体而言是该酶性止血剂能够拮抗水蛭素类药物引起的出血倾向，从而扩大了水蛭素类抗凝药的临床应用前景。复方水蛭滴眼液的制备与工艺本发明公开了一种治疗白内障及其他眼病的中药配方及其制作方法复方水蛭滴眼液的制备与工艺。采用水蛭，蜂蜜，萄萄糖酸锌和尼泊金乙酯按 203018220.81.2的比例加入双蒸水制成滴眼液。制作工艺是将葡萄糖锌加入水蛭蜂蜜浸出液，调节pH、渗透压，加水至全量，混匀、过 滤、分装、消毒即得成品。用本品滴眼可治疗老年性白内障，有效率达66；尚可用于治疗后发性白内障、老年黄斑变性、视网膜色素变性、角膜炎、结膜炎以及 玻璃体混浊。用于由大肠杆菌向培养基中分泌来制备Leu-水蛭素的信号序列本发明涉及一种含有一种信号序列和Leu-水蛭素序列的水蛭素前体及其制备方法和用途，并涉及一种寻找用于在大肠杆菌中分泌表达任何目的蛋白的信号序列的方法和用于在大肠杆菌中分泌表达任何目的蛋白的方法。水蛭素干粉吸入剂及其制备方法本发明公开了一种水蛭素干粉吸入剂及其制备方法，该吸入剂由水蛭素纯品干粉或由水蛭素干粉添加适当辅料制成的混合物微粉，其微粉粒径0.1-1000微 米，水蛭素与辅料的重量比范围为10-1000。水蛭素干粉吸入剂的制备方法是首先将水蛭素或水蛭素添加适当辅料后，通过粉碎、喷雾干燥、结晶或聚合 方法制成粒径在0.1-100微米的微粉；其次将微粉团聚或者与辅料颗粒结合制成粒径在1-1000微米之间的可再分散颗粒，最后将微粉或颗粒包装入胶 囊、泡罩或干粉吸入器内。该干粉吸入剂使用时由呼吸道吸入。肺部吸收，它具有使用方便、容易保存、生物利用度高的优点。一种以水蛭粉为单一活性成分的活血通脉薄膜包衣片剂一种以大剂量水蛭粉为单一活性成分的活血通脉薄膜包衣片剂，在这种片剂中，水蛭粉的含量为250500mg/片。水蛭提取物美容护肤液及其制备方法本发明公开了一种美容护肤液，它包括水蛭提取物、辅料和干净水，制备方法是把一定活性量的水蛭提取物和辅料完全溶于水中即得到本发明最终产品，它具有两个 特点：一是自主渗透，皮肤吸收快且抗炎和消肿，对预防皮肤衰老、消除色斑、粉刺以及新旧疤痕均有独特的效果；二是使用方便，更适合在炎热季节时使用，对油 脂性皮肤的人群更为适用。天然水蛭素软膏一种天然水蛭素软膏，其配方中含有天然水蛭素和常规的软膏基质，以100克软膏计，含有天然水蛭素100200000国际单位。本发明软膏为外用剂型， 它具有易透皮吸收、见效快、疗效短，且副作用很小等优点。对治疗浅表性血栓静脉炎、烧伤、皮肤皱裂、皮肤溃疡、冻疮、痤疮、粉刺、妇女外阴搔痒、血肿、暗 疮、痔疮等症以及在软化疤痕和预防疤痕增生等方面均具有显著的疗效。天然水蛭素舌下含片一种天然水蛭素舌下含片，其特征在于该含片中含有天然水蛭素和水溶性填充剂，每片含片中含天然水蛭素56000国际单位。本发明具有易吸收、疗效好的优点，对防治心脑血管疾病如高血压、高脂血症、中风及其后遗症等均有很好的效果。一种水蛭指纹图谱的建立方法和水蛭药材的鉴别方法本发明提供一种中药水蛭HPLC指纹图谱建立的方法及其标准指纹图谱。首先制备水蛭药材溶液，取水蛭最粗粉适量，精密称重，以生理盐水作为溶剂室温浸泡 16小时，离心，取上清液用微孔滤膜(0.45um)过滤，作为水蛭对照药材溶液；其次制备参照物溶液，取次黄嘌呤对照品适量，精密称重，用流动相溶解、 稀释，制成参照物溶液；最后，进行测定，分别精密吸取水蛭对照药材溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录50分钟色谱，其中高效 液相色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液和50甲醇的梯度洗脱液，检测波长为254nm。将 待测水蛭样品指纹图谱与标准指纹图谱对比，比较其异同。本发明的优点是方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握。烫水蛭配方颗粒的制备方法本发明涉及一种水蛭配方颗粒的制备方法，包括以下过程：取烫水蛭饮片，加水煎煮二次，一煎加8-12倍量水，二煎加6-10倍量水，合并煎液，滤液在真空 度0.06-0.09MPa下减压浓缩至相对密度为1.08-1.12的清膏；喷雾干燥，制成干浸膏粉，加糊精或乳糖或麦芽糊精，加硬脂酸镁，混匀；轧辊 干法制粒，轧辊主压力20-40kg/cm2、轧辊侧压力10-20kg/cm2、轧辊转速 15-20r/min、送料速度100-150r/min，整粒，制成18-40目颗粒，成品烫水蛭配方颗粒中各成份重量份为：烫水蛭100份，糊精或乳 糖或麦芽糊精1.6-3.7，硬脂酸镁0.08-0.17。该方法，过程简单，工艺合理，药效成分不受损失，得到的烫水蛭配方颗粒中含氨基氮不得少于 10mg/g；含抗凝血酶活性不得少于16.0U/g；含次黄嘌呤不得少于2mg/g。水蛭素鼻腔给药制剂及其用途本发明涉及一种抗凝抗栓多肽药物水蛭素的给药新途径，具体涉及水蛭素通过鼻腔给药的制剂及其用途。本发明制剂配方组成为：水蛭素、吸收促进剂、防腐 剂、pH调节剂，水或生理盐水等。以上述配方组成制备的水蛭素鼻腔给药制剂，可以为滴剂、喷雾剂、凝胶剂或软膏剂。本发明制剂的制备工艺为：将配方量的防 腐剂加入适量水或生理盐水中，搅拌(或加热)使之溶解后，依次加入吸收促进剂(必要时先用丙二醇溶解)、水蛭素搅拌使之完全溶解，加入剩余部分水或生理盐 水，用醋酸调pH至46，即得。此法可用于滴鼻剂或喷鼻剂的制备；若再加入常规比例的常规辅料可制成软膏剂或凝胶剂。本发明的制剂主要用于预防和/或治 疗各种血栓性疾病的应用。一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法与应用本发明公开了一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法与应用，该制备方法的特征在于包括吸血水蛭制浆、配制悬浊液和干燥三个步骤，所得到的粉末，它保存了吸 血水蛭最主要的有效活性成分天然水蛭素。本发明具有工艺简单、生产成本较低、产品保存期长、并可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测天然水蛭 素含量，从而使质量稳定，产品疗效有保证等特点。水蛭素应用范围广泛，可通过常规的方法单独做成胶囊、软胶囊、颗粒剂、片剂使用，或与其它动、植物药制成 复方制剂，用于防治脑中风、高血压、高脂血症、冠心病等心脑血管疾病。水蛭素抗血栓气雾剂制造技术本发明涉及一种治疗心脑血管疾病的气雾剂制造技术，属于中药制剂技术领域。该技术特征在于含水蛭素的气雾剂的制备。本发明的水蛭素抗血栓气雾剂具有携带方便、起效迅速、疗效确切、对心血管系统疾病起到保健和急救作用。一种水蛭多肽冻干粉针制剂及其制备方法本发明公开了一种水蛭多肽注射制剂及其制备方法，其特征在于水蛭多肽提取过程采用水为溶剂，纯化过程单独使用两组效果最佳的阳离子交换葡聚糖凝胶色谱柱和 阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱。纯化后加或不加药用辅料，制备成水蛭多肽注射制剂；其特征还在于提取过程不使用任何有机试剂；该制备方法简单，操作过程无环 境污染，省时节源并且使水蛭多肽的纯度大大提高，同时抗凝血活性得到了显著的提高，采用该纯化方法得到的水蛭多肽的凝血酶比活为132。一种以水蛭提取物为活性成分的中药肠溶口服制剂及其制备方法一种以水蛭药材为原料，经本发明所述工艺提取得到活性成分。为了避免其中活性(多肽物质)成分在上消化道被各种消化酶、酸性物质破坏而失活，通过各种技术 手段制备成口服肠溶制剂，这些肠溶制剂包括肠溶片剂、肠溶胶囊剂、肠溶滴丸剂、肠溶软胶囊等。该制剂可用于不稳定心绞痛、急性心肌梗塞、脑出血等症的治 疗；也可用于预防深层静脉血栓的形成、血管成形术后的血管再闭塞等症状。一种含有西洋参提取物、水蛭提取物和红花黄色素的新的药物组合物本发明属于医药技术领域，公开了一种药物组合物及其制备方法和用途，该组合物主要由西洋参提取物、水蛭提取物和红花黄色素组成，三者可以按如下配比组成： 西洋参提取物10200份、水蛭提取物5100份、红花黄色素10200份；三者可以单独或与药用辅料组合，制成临床上或药学上可接受的剂型，如注 射剂、口服常释剂型、缓释控释剂型、颗粒剂、丸剂、口服液体剂等；三药合用，可协同发挥扩张血管、改善心肌血供、抗凝血、抗血栓、抗缺氧、降血脂等药理作 用，可用于冠心病、心绞痛、脑梗阻、脑血栓等疾病。以油体蛋白作载体在转基因大豆中生产重组水蛭素的方法本发明涉及以油体蛋白作载体在转基因大豆中生产重组水蛭素的方法。将人工合成的、按照植物所偏爱的密码子优化后的水蛭素基因及蛋白酶切割识别信号与油体蛋 白基因进行体外拼接，然后通过转基因途径以融合蛋白的方式在大豆中表达并定位在大豆油体的表面，从大豆种子中分离出油体及融合改造后的油体蛋白并经蛋白酶 进行特异性切割可释放出有活性的重组水蛭素蛋白。一种水蛭的真空冷冻干燥方法本发明涉及一种水蛭的处理方法，特别涉及一种水蛭的真空冷冻干燥方法。主要解决油炸法破坏水蛭有效成分的技术问题。本发明的技术方案为：一种水蛭的真空冷 冻干燥方法，包括以下步骤：预处理过程：将养殖好的水蛭禁食24天，流水清洗；预冻过程：将已经预冻好的水蛭进行切块，并装盘；将水蛭的中心温度降低到 -35-45，使其全部冻结；升华干燥过程：将冷井的温度降到-46-55，开始抽真空，当降到2535Pa时，根据水蛭的重量，调节板层温 控，使得水蛭在升华过程中温度一直低于-25-35，当真空室压力达到25Pa时，升华过程结束；解析干燥过程：将板温设为2535，并保持恒 定，当真空室压力达到25Pa时，解析过程结束。本发明主要用于水蛭的干燥。一种水蛭保健药酒及其生产方法本发明公开了一种水蛭保健药酒及其生产方法，它是由按一定重量份比例的水蛭、枸杞、银杏叶提取物、蜂蜜和酒，经传统浸泡工艺精制而成；它保存了水蛭中最主 要的有效活性成分天然水蛭素，并可采用凝血酶直接滴定法检测其含量，产品质量稳定。本保健药酒具有改善血液循环、促进新陈代谢，扩张毛细血管、降低血 液粘度、清除自由基等功效，从而可防治富贵病，解决亚健康的问题。水蛭素的制取方法本发明公开了一种水蛭素的制取方法。该方法不以水蛭虫体为原料而是将养殖水蛭的水进行处理，以经过处理的养殖水蛭的水处理液替代现有工艺中的水蛭提取液来制取水蛭素的制取方法。水蛭和/或地龙分子量5800道尔顿以下的提取物本发明提供一种水蛭和/或地龙分子量5800道尔顿以下提取物及其制备方法和药物组合物、用途。所述的水蛭和/或地龙分子量5800道尔顿以下提取物，在 产品的可见异物和不溶性微粒等方面，明显优于已有的水蛭和/或地龙提取物，产品的安全性也大大提高。本发明的产品可用于制备预防或治疗血栓性疾病的药物。一种天然水蛭素有效成分的提取方法本发明公开了一种天然水蛭素有效成分的提取方法，是用水清洗吸血水蛭干净后加入含量1525的乙醇水溶液浸泡30-50小时后，过滤，得滤液和药渣； 将菲牛蛭药渣绞碎，再加含量1525的丙酮水溶液浸泡，滤过，得滤液，分别将两次滤液真空回收乙醇和丙酮后，合并滤液，常规真空冷冻干燥，得到产品。 本发明工艺简单、成本低廉，收率较高、产品质量好、保存期长，整个生产过程无“三废”排放，产品作为医药、美容、保健食品三大领域的原料。一种治疗心脑血管疾病的水蛭微粉制剂及其制备方法本发明公开一种治疗心脑血管疾病的水蛭微粉制剂及其制备方法。将符合国家药典规定的水蛭药材70以下干燥，在20以下超微粉碎成为细度达到200 目以上的水蛭微粉，加入0-10辅料，混匀填充胶囊，制成硬胶囊；或将与油类辅料混匀的水蛭微