实验八.SDS-PAGE测定蛋白质分子量.ppt

SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 测定蛋白质分子量 实验目的 学习PAGE分离蛋白质的原理学习SDS PAGE测定蛋白质分子量的原理 掌握垂直板电泳的操作方法 运用SDS PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定 一 PAGE分离蛋白质的原理 PAGE根据其有无浓缩效应 分为连续系统和不连续系统两大类 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同 带电颗粒在电场作用下 主要靠电荷和分子筛效应 不连续系统中由于缓冲液离子成分 pH 凝胶浓度及电位梯度的不连续性 带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应 分子筛效应 还具有浓缩效应 因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE Polyacryamidegelelectrophoresis 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法 由于其分辨率高 不仅能分离含有各种大分子混合物 而且可以研究生物大分子的特性 如电荷 分子量 等电点及分子构型 聚丙烯酰胺凝胶的合成 催化剂聚合反应 聚丙烯酰胺凝胶的三维网状结构 稀溶液 浓溶液 交联剂 凝胶 结点 T X100 a b m C x100 b a b C 6 5 0 3T 配制凝胶浓度计算及经验公式 凝胶浓度的计算 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度 弹性 透明度 粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度 C是与T有关的交联百分浓度 T与C的计算公式是 上式中a为丙烯酰胺的克数 b为甲叉双丙烯酰胺的克数 m为水或缓冲液体积 ml 式中a与b的比例很重要 富有弹性 且完全透明的凝胶 a与b的重量比应在30左右 聚丙烯酰胺的聚合及影响因素 化学聚合 以过硫酸铵 AP 为催化剂 以四甲级乙二胺 TEMED 为加速剂 使丙稀酰胺 甲基双丙稀酰胺发生连锁反应形成网状的聚合物 丙稀酰胺由过硫酸铵 AP 在碱性条件下产生游离氧自由基引发单体丙稀酰胺成为自由基状态而成的 在碱性PH时 反应速率迅速 而在酸性条件时 同样浓度溶液 聚合速率减慢 在低温时聚合 凝胶会变得脆而浑浊 且重复性差 在25 聚合的凝胶则较透明和有弹性 分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合 O2使过硫酸铵 AP 分解 故在做胶后常要用水进行封闭 金属离子也干扰凝胶的化学聚合 光聚合 以核黄素为催化剂在少量的氧存在下 分解成无色的还原型 在少量的O2条件下 还原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环 聚合反应发生 用量少 不会对样品有任何不良的干扰现象 故常用于样品胶的聚合 聚合的时间可以自由控制缺点 光照的量不容易掌握 重现性不太好 光聚合适合大孔径凝胶的聚合 化学聚合适合各种凝胶的聚合 核黄素B1还原型游离基聚合反应 光照 O2 聚丙烯酰胺凝胶的孔径和分子筛效应 凝胶是具有高粘度 高摩擦阻力的支持介质 能起到防止对流 把扩散减到最小 而且能影响大分子颗粒的移动过程 大分子在凝胶中的分离是受其所带的电荷 尺寸 和形状因素的影响 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力 Sizesievingcapacity 故将此现象称为分子筛效应 Molecularsievingeffect 有效孔径取决于凝胶的总浓度T 孔径随着T 的增加而减小 甲基双丙稀酰胺的浓度为5 时 有效孔径最小 T 5 时 甲基双丙稀酰胺的浓度为5 时 孔径为20nm T是凝胶溶质的总百分浓度 C是与总浓度相关的交联百分浓度 故T是决定C 分离物的分子量的大小又决定了T的浓度 579111315T AB 凝胶浓度T对样品迁移率的影响 例 混合蛋白质A B A分子量较小 B分子带电荷较多 T 5 时 电泳行为主要以电荷起作用 B迁移速度快 当T增加 分子筛效应增加 B的迁移速度减慢 T 9 时 A B的迁移率相同 不能分开 T再增加 凝胶孔径更小 A分子比B分子小 表现较高的迁移率 并且说明电泳只获得单一的带时 并不能证明是单一的均一成分 迁移率 不连续凝胶电泳 disc 的分离原理 一 原理不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的 电荷效应分离外 还具有 浓缩效应与 分子筛效应 因而 能提高电泳的分辨率 使电荷性质与密度相近的但分子量有差别的分子得以分离 或分子量相近 性质一样 电荷性质与密度有差别的分子可以分离 或电荷性质 分子量大小相近 但构型不同时亦可分离 碱性不连续 分离酸性样品不连续凝胶电泳洗脱酸性不连续 分离碱性样品大多数蛋白质分子呈酸性或中性 适合用碱性系统进行电泳分离 浓缩效应 1 凝胶的组成 浓缩胶为大孔径 稀 T 5 分离胶一般为小孔径 浓 T 7 5 样品在较稀的凝胶上自由迁移 直至浓凝胶时 便形成一道栅栏 所有的样品分子在浓缩胶的界面堆积成一窄带 得到浓缩 然后 再依据分子量的大小进行电泳分离 2 缓冲液的组成 图示 PH系统的不连续 各种分子的电荷之间的差异进行分离 3 缓冲体系的不连续 其中各组成的离子 快慢离子迁移快慢的差别是影响样品浓缩效应的重要因素 4 离子的迁移速率及浓度的不连续又造成电场强度与电导率的变化 分子筛效应 移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时 凝胶的PH变化明显 缓冲液中甘氨酸的觧离迅速增加 直至完全觧离出gly 其分子量小 迁移超过蛋白质分子 而丧失夹击的作用 同时 凝胶的孔径变小 降低了蛋白质的迁移率 故蛋白质分子在均一的电压梯度和PH值中泳动 依其分子量的大小而分开 电荷效应 蛋白质所带的净电的性质和电荷量与分子的迁移率的关系 在同一电场强度中 在单位时间内各分子迁移的距离的差别而到达分离 操作 垂直柱状 板状的不连续凝胶电泳系统的组成和配制 均一凝胶与梯度凝胶配制 电极缓冲液系统 样品的准备 加样要求电泳检测 PH8 3PH6 7PH8 9PH8 3 垂直柱状 板状的不连续凝胶电泳系统的组成和配制 缓冲液系统 浓缩凝胶缓冲液0 5mol LTris HCl PH6 8分离凝胶缓冲液1 5mol LTris HCl PH8 8电极缓冲液系统0 025mol LTris 三羟甲基氨基甲烷 0 2mol Gly 甘氨酸 PH8 3样品缓冲液0 1mol LTris HCl PH6 8 40 甘油 0 05mg ml溴酚蓝样品缓冲液的要求 选择合适的PH与离子强度 以保证样品的溶解性 稳定性 生物活性 并加入便于观察电泳前沿的指示剂 标准蛋白质样品 标准蛋白质样品 是一组 5 7种 已知的合适的分子量范围的 构形相近的一套蛋白质 溶解在样品缓冲液中备用 样品的浓度分析目的 检测方法和样品的组成是关键 未知样品浓度 0 1 20mg ml考玛斯亮篮染色 1 2mg ml银染色 0 02 0 2mg ml高纯度样品 0 5 2mg ml加样电泳光吸收检测考玛斯亮篮染色染色银染色 二 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 测定蛋白质的分子量 SDS PAGE 主要用于测定蛋白质亚基的分子量 与其它方法相比 它不需要昂贵的仪器设备 操作简便 能在较短的时间内得到结果 有较高的重复性 且不需要非常纯的样品 因此是目前用于测定蛋白质亚基的分子量的一种最好的方法 实验原理 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS 十二烷基硫酸钠 SDS能断裂分子内和分子间氢键 破坏蛋白质的二级和三级结构 强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂 蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中 与SDS分子按比例结合 形成带负电荷的SDS 蛋白质复合物 这种复合物由于结合大量的SDS 使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块 从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异 由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的 因此在进行电泳时 蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小 当分子量在15KD到200KD之间时 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系 符合下式 logMW K bX 式中 MW为分子量 X为迁移率 k b均为常数 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图 可获得一条标准曲线 未知蛋白质在相同条件下进行电泳 根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量 实验原理 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中 特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度 影响它们结合的因素主要有三个 溶液中SDS单体的浓度 当单体浓度大于1mmol L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1 1 4 如果单休浓度降到0 5mmol L以下时 两者的结合比仅为1 0 4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别 为保证蛋白质与SDS的充分结合 它们的重量比应该为1 4或1 3样品缓冲液的离子强度 SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低 通常是10 100mmol L二硫键是否完全被还原 实验原理 采用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时 只有完全打开二硫键 蛋白质分子才能被解聚 SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系 因此在用SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理 巯基乙醇是一种强还原剂 它使被还原的二硫键不易再氧化 从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合 有许多蛋白质是由亚基 如血红蛋白 或两条以上肽链 如胰凝乳蛋白酶 组成的 它们在SDS和巯基乙醇作用下 解离成亚基或单条肽链 因此这一类蛋白质 测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW 已发现有些蛋白质不能用SDS PAGE测定分子量 如电荷异常或构象异常的蛋白质 带有较大辅基的蛋白质 某些糖蛋白 以及一些结构蛋白 如胶原蛋白等 一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量 互相验证 实验试剂和器材 1 材料 低分子量标准蛋白试剂盒 低分子量标准蛋白 兔磷酸化酶BMW 97 400牛血清白蛋白MW 66 200兔肌动蛋白MW 43 000牛碳酸酐酶MW 31 000胰蛋白酶抑制剂MW 20 100鸡蛋清溶菌酶MW 14 400根据说明书处理标准蛋白样品 称3mg样品 加2ml蒸馏水溶解 2 实验试剂 1 30 丙烯酰胺 Acr 称Acr30g 甲叉双丙烯酰胺 Bis 0 8g 加蒸馏水至100ml 过滤后置棕色瓶中 4 贮存可用1 2月 2 10 SDS 十二烷基硫酸钠 3 1 5mol LpH8 8Tris HCl分离胶缓冲液 称取Tris18 2g加入50ml水 用1mol L盐酸调pH8 9 最后用蒸馏水定容至100ml 4 1 0mol LpH6 8Tris HCl浓缩胶缓冲液 称取Tris12 1g 加入50ml水 用1mol L盐酸调pH6 8 最后用蒸馏水定容至100ml 5 0 05mol LpH6 8Tris HCl样品溶解缓冲液 称取Tris0 6g 加入50ml水 用1mol L盐酸调pH6 8 最后用蒸馏水容至100ml 7 10 过硫酸铵 AP 8 TEMED 四甲基乙二胺 9 样品溶解液 SDS 100mg 巯基乙醇 0 1ml 溴酚蓝 2mg 甘油 2g 0 05mol LpH8 3Tris HCl 2ml 最后定容至10ml 10 固定液 取50 甲醇454ml 冰乙酸46ml混匀 11 染色液 称取考马斯亮蓝R2500 125g 加上述固定液250ml 过滤后备用 12 脱色液 冰乙酸75ml 甲醇50ml 加蒸馏水定容至1000ml 13 电极缓冲液 内含0 1 SDS 0 05mol LTris 0 384mol L甘氨酸缓冲液pH8 3 称Tris6 0g 甘氨酸28 8g 加入SDS1g 加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml 2 实验试剂 3 实验器材 垂直板电泳装置直流稳压电源移液管 滤纸微量注射器大培养皿 各部分凝胶配制 参看实验指导P57 操作步骤 1 将玻璃板用蒸馏水洗净晾干 准备2个干净的锥形瓶 2 把玻璃板在灌胶支架上固定好 固定玻璃板时 两边用力一定要均匀 防止夹坏玻璃板 3 按比例配好分离胶 用移液管快速加入 大约5cm左右 之后加少许蒸馏水 静置40分钟 凝胶配制过程要迅速 催化剂TEMED要在注胶前再加入 否则凝结无法注胶 注胶过程最好一次性完成 避免产生气泡 操作步骤 水封的目的是为了使分离胶上延平直 并隔绝空气 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面 4 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干 按比例配好浓缩胶 连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处 迅速插入样梳 静置40分钟 样梳需一次平稳插入 梳口处不得有气泡 梳底需水平 操作步骤 5 在上槽内加入缓冲液后 拔出样梳 要使锯齿孔内的气泡全部排出 否则会影响加样效果 6 加样 1 取10 l标准蛋白溶解液于EP管内 再加入10 l2倍样品缓冲液 上样量为10 l 2 取10 l样品溶液 再加入10 l2倍样品缓冲液 上样量分别为5 l和3 l 7 用微量注射器距槽底三分之一处进样 加样前 样品在沸水中加热3分钟 去掉亚稳态聚合 注射器不可过低 以防刺破胶体 也不可过高 在样品下沉时会发生扩散 为避免边缘效应 最好选用中部的孔上样 操作步骤 8 电泳槽中加入缓冲液 接通电源 进行电泳 开始电流恒定在10mA 当进入分离胶后改为20mA 溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时 停止电泳 9 凝胶板剥离与染色 电泳结束后 撬