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文档简介

第四次实验 ELISA法检测抗 HBs 实验目的 1 掌握ELISA的原理和操作方法2 实验原理 本实验采用ELISA双抗体夹心法检测抗 HBs Ag 首先用已知抗HBs抗体包被载体 然后加入待测血清 共同孵育后 抗原结合于包被抗体上 在加入酶标记抗HBs抗体 酶标抗体连接到抗原上 最后加入底物溶液 根据颜色反应来判定抗原含量 实验材料 1 豚鼠Anti HBs 2 待测血清 阳性 阴性对照血清 3 HBR标记豚鼠Anit HBs 4 包被缓冲液 0 05mol LpH9 6碳酸缓冲液 5 洗涤液 0 01mol LpH7 4Tris Cl Tween20 6 稀释液 0 01mol LpH7 4PBS 7 显色液 邻苯二胺 pH5 0碳酸盐 柠檬酸缓冲液 8 终止液 2mol LH2SO4 9 酶仪表 冰箱 实验步骤 1 包被用0 05mol LpH9 6碳酸缓冲液稀释豚鼠Anti HBs至50 g ml 然后将稀释好的豚鼠Anti HBs用微量移液器加入反应板 每孔0 2ml 放湿盒内 置37 温育2h 在转入4 冰箱过夜 2 洗涤将包被液到掉后 用洗涤液 0 01mol LpH7 4Tris Cl Tween20溶液洗涤3次 每次持续3min 3 加样将待测血清用稀释液 0 01mol LpH7 4PBS 稀释 从1 100 1 200至1 6400 然后用移液器分别加入1 7个孔 每孔0 1ml 第8孔加阳性对照血清 第9孔加阴性对照血清 第10孔加PBS做空白对照 将应用板置于37 孵育2h 4 洗涤同步骤2 5 加酶标记物将酶标记豚鼠Anti HBs加入反应板 每孔0 1ml 置37 温育2h 6 洗涤同步骤27显色每孔加显色液 临用前配制 0 1ml 置37 作用15min 8 终止反应每孔加入2mol LH2SO40 5ml 实验结果 当P N 2 1时判为阳性 以出现阳性结果的最高血清稀释孔的血清稀释度为该血清的 HBs Ag 效价 将反应板置酶标仪上测定各孔的光密度 A值或OD值 然后按下列公式计算 判断阴阳性结果 注意事项 1 包被缓冲液 洗涤液 稀释液等可提前配制 于冰箱中短期保存 使用前观察是否变质 2 加样量力求准确 加样时应将液体加入孔底 避免加在孔壁上部 并出现气泡 3 ELISA操作需要一定温度孵育 为避免蒸发 酶标板上应加盖 或将酶标板平放在底部垫有纱布的湿盒中 4 洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合物以及反应
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