总RNA的提取定量与RT-PCR.doc

生物化学实验报告姓 名： 学 号： 专业年级： 级临床八年制 组 别： 第二实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称(Title of Experimetn)总RNA的提取、定量与RT-PCR实验日期(Date of Experiment)11月27日实验地点(Lab No.)第二实验室合作者(Partner)指导老师(Instructor)总分(Total Score)教师签名(Signature)批改日期(Date)【预习报告】一、 实验原理1)总RNA的提取与定量在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5g RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50100mg组织、5106细胞）也适用于大量样品（1g组织、107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNase处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于western blotting。 2)逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 二、 实验材料1)总RNA 的提取1. 紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管 2. Trizol试剂 3. 氯仿 4. 异丙醇 5. 75乙醇6. 无RNase的水或0.5SDS (溶液均需用DEPC处理过的水配制) 2)RT-PCR1. 基因扩增仪(如PE GeneAmp PCR System 2400 或 9700)、微量加样枪、凝胶成像系统、灭菌超薄PCR反应管 2RNA提取试剂 3第一链cDNA合成试剂盒4dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L5Taq DNA聚合酶 三、 实验步骤（一）总RNA的提取 1. 匀浆处理: a.组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml Trizol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过Trizol体积10。 b.单层培养细胞 直接在培养板中加入Trizol裂解细胞，每10cm2面积加1ml，用移液器吸打几次。Trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。Trizol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。 c.细胞悬液 离心收集细胞，每5-10106动物、植物、酵母细胞或1107细菌细胞加入1ml Trizol，反复吸打。加Trizol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。 (注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与Trizol的比例，细胞的数量不能过多。) 2. 将匀浆样品在室温（15-30）放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8 10000g离心10 min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。 4. 每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3 min。 (注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。) 5. 2-810000g离心15 min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60。 6. 把水相转移到新管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml Trizol加入0.5ml异丙醇，室温放置10 min。 7. 2-810000g离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。 8. 用75乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml 75乙醇。2-8不超过7500g离心5 min，弃上清。 9. 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾5-10min。加入25-200l无RNase的水，-70保存。 （二）RT-PCR 1. 总RNA的提取：见前述内容。 2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以TAKARA公司提供的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒为例。 （1）在0.2ml微量离心管中，加入以下： 总RNA 1-5 g 、dNTP 1 l 、Random primer 1 l 、补充适量的DEPC H2O使总体积达10 l。轻轻混匀、离心。 （2）PCR仪上65加热5min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。 （3）然后加入下列试剂的混合物： 5PrimeScript buffer 4 l 、RNase inhibator 0.5 l 、RTase 1 l 、RNase free H2O 4.5 l ，轻轻混匀，离心. （4） 30孵育10 min。 （5） 42孵育60 min。 （6）于70加热15 min以终止反应，将管插入冰中。 3PCR：本次实验采用Premix Taq Version2.0(Loading dye mix)试剂 （1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 l 、上游引物（10pmol/L）2 l 、下游引物（10pmol/L）2 l 、dNTP(2mmol/L) 4 l 、10PCR buffer 5 l 、Taq酶（2U/l） 1 l 。（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50 l。轻轻混匀，离心。 （3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G-3-PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。 （4）电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。 （5）结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。 四、实验注意事项1、本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。2、快速的操作，低温环境，少量取上清 主要是抽提之后吸取上清时要特别小心，只要不把蛋白层吸出来就不会有RNase污染。3、加样原则是酶最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。【实验记录】一、 实验条件见第一、第二部分。二、 实验现象1、 琼脂糖凝胶电泳图像：反转录DNA条带MARKER带从凝胶电泳的图像上看，本组的反转录DNA条带可以看到与MARKER带对应的特异性条带，但特异性不明显，也出现了弥散或非特异性条带。【结果与讨论】一、结果如上图所示。三、 讨论（1）特异性反转录DNA条带不明显,